УДК 579.6
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БИОСИНТЕЗА ПОЛИГИДРОКСИБУТИРАТА Methylobacterium extorquens G10 И Methyloligella halotolerans С2 НА МЕТАНОЛЕ
© 2014 г. М. Н. Порошина*, **, Н. В. Доронина*, **, В. А. Ежов*, Ю. А. Троценко*, **
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, 142290 **Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино, 142290 e-mail: trotsenko@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 21.10.2013 г.
Проведено сравнительное изучение биосинтеза полигидроксибутирата метилобактериями Methylobacterium extorquens G10 и Methyloligella halotolerans С2, реализующими сериновый путь Ci-метабо-лизма. Лимитирование по азоту стимулировало синтез биополимера обеими культурами. Показано, что метилобактерии синтезировали полимеры с разной молекулярной массой, несмотря на сходство путей метаболизма метанола и биосинтеза полигидроксибутирата. При увеличении содержания остаточного азота в среде для культивирования M. extorquens G10 уменьшалась молекулярная масса полимера (250 ^ 85 кДа), тогда как M. halotolerans С2 синтезировал высокомолекулярный полимер (~3000 кДа) независимо от остаточного содержания источника азота. Установлено, что исследуемые метилобактерии использовали метанол-сырец аналогично чистому метанолу, что существенно снижало себестоимость получаемого полигидроксибутирата.
DOI: 10.7868/S0555109914030295
Полигидроксибутират (ПГБ) синтезируется многими прокариотами при несбалансированных условиях роста (лимитирование по одному из компонентов питательной среды — азоту, фосфору, калию и др. при избытке углерода) и является для клеток резервным субстратом эндогенного дыхания [1, 2]. Получаемый микробиологическим способом ПГБ имеет широкие перспективы применения благодаря биоразлагаемости, биосовместимости и термопластичности [3].
Основные свойства ПГБ — молекулярная масса (Мм), степень кристалличности и термопластичность — могут варьировать в достаточно широких пределах вследствие генетических особенностей продуцентов, условий синтеза и выделения полимеров [4]. Направленный синтез ПГБ с заданными характеристиками — сложная технологическая задача, решение которой требует фундаментальных знаний о механизме синтеза и влиянии структуры на физико-химические свойства полимера [5, 6].
В биотехнологическом производстве себестоимость продукта на 40% определяется ценой источника углерода [7]. Аэробные метилотрофные бактерии, использующие дешевый возобновляемый субстрат метанол в качестве источника углерода и энергии, считаются перспективными продуцентами ПГБ [8]. Большинство известных ме-тилотрофных продуцентов синтезируют ПГБ с низкой Мм, что обусловливает хрупкость полимера [9]. У Ме1Ну1оЬас1егшт ех1ощыет 010 повы-
шения эластичности полимера удалось достичь синтезом сополимера — ПГБ — из смеси метилового и амилового спиртов [10]. Однако недавно из почвы выделен представитель нового рода облигат-ных метилотрофов — МеНу1оЩе11а НаШокгат С2, синтезирующий достаточно прочный и эластичный ПГБ из метанола [11].
Цель работы — сравнительное изучение параметров биосинтеза ПГБ из метанола аэробными метилобактериями М. ех1ощыет 010 и М. НаШо1-егат С2 и характеристика основных физико-химических свойств синтезируемых биополимеров.
МЕТОДИКА
Объектами исследования служили М. ех1ощыет 010 [10] и М. НаЫо1егат С2 [11].
Состав сред и условия культивирования. М. ех-
одыет 010 выращивали на минеральной среде следующего состава (г/л): КН2Р04 — 1.0; Ш2НР04 • 12Н20 - 1.0; (МН4)^04 - 1.0; Ы§804 •
• 7Н20 — 0.1, 10 мл раствора микроэлементов. Раствор микроэлементов содержал (г/л): СоС12 • Н20 — 0.5; СаС12 • 6Н20 — 0.5; М^04 • Н20 — 0.2; 2^04 •
• Н20 — 0.5; Ш2Мо04 — 0.02; С^04 • 5Н20 — 0.1; FeS04 • 7Н20 — 1.0. Необходимое значение рН среды (7.0) устанавливали 10%-ным раствором №0Н.
Культивирование проводили в колбах Эрлен-мейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл среды с метанолом (0.5% об./об.), на роторной качалке
(180 об/мин) при 29° С в течение 2 сут. Культуру в середине логарифмической фазы роста (ОП600 = = 1.0) использовали в качестве посевного материала (инокулята) для ферментера. Периодическое культивирование в ферментере Анкум-2М ("Биоприбор", Россия) проводили в режиме автоматического поддержания температуры 30°С и pH 6.85. В ферментер вносили 4.0 л минеральной среды и 200 мл посевного материала. Необходимое значение pH поддерживали 25%-ным раствором NH4OH или 10%-ным раствором NaOH.
При достижении культурой ОП600 = 30 (15 г/л сухой биомассы) добавляли 50 мл концентрированной среды, содержащей (г/л): H3PO4 — 270; MgSO4 • 7H2O - 80; FeSO4 • 7H2O - 2.3; CaCl2 • 6H2O -0.6; MnSO4 • H2O - 0.3; CoCl2 • H2O - 0.5; ZnSO4 • • H2O - 0.6; CuSO4 • 5H2O - 0.4.
По мере потребления растущей культурой метанола его добавляли порциями от 5 до 20 мл. Отсутствие метанола в среде определяли по резкому увеличению уровня растворенного кислорода (pO2). Поддерживали pO2 на уровне 20-30% от насыщения, увеличивая число оборотов мешалки до 1000 об/мин и расход воздуха до 6 л/мин.
M. halotolerans С2 выращивали на минеральной среде следующего состава (г/л): MgSO4 • 7H2O - 0.2, NaCl - 0.5; (NH4)2SO4 - 1.0; CaCl2 • 6H2O - 0.15; NaH2PO4 • 2H2O - 0.5; K2HPO4 • 3H2O - 1.0; 5 мл раствора микроэлементов (см. выше) и 5 мл дрожжевого автолизата, так как культура нуждалась в витаминах. Получение посевного материала и культивирование в ферментере Анкум-2М проводили при pH 7.1 так же, как и для культуры M. extorquens G10. Наряду с чистым метанолом, для культивирования метилобактерий использовали метанол-сырец, стоимость которого более чем на порядок ниже.
Содержание биомассы определяли, измеряя оптическую плотность (ОП600) культуральной жидкости в кювете (0.5 см) на спектрофотометре Specol 221 ("Carl Zeiss", Германия), и пересчитывали на вес сухой биомассы по калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой отбирали 50 мл суспензии клеток с известной оптической плотностью, центрифугировали (10000 g, 20 мин), осадок высушивали при 105°С до постоянной массы и взвешивали. Концентрацию NH+ в культуральной среде определяли на иономере МА-130 ("Mettler Toledo GmbH", Швейцария) с аммонийным электродом.
Для выделения ПГБ культуральную жидкость центрифугировали при 10000 g 30 мин, навеску сырой биомассы перемешивали с 6 об. метанола в течение 1 ч, затем центрифугировали при 5000 g. Из осадка экстрагировали ПГБ 6 об. хлороформа в течение 3 ч. Суспензию фильтровали через филь-
тровальную бумагу (РЕКОМ, Синяя лента). Экстракт осветляли активированным углем марки А (0.5%, вес/об.) при перемешивании в течение 1 ч и фильтровали через слой фильтровальной бумаги на воронке Бюхнера под вакуумом. Осветленный экстракт упаривали на роторном испарителе приблизительно в 5-6 раз (до состояния жидкого киселя). Концентрат при энергичном перемешивании переносили в 6-кратный объем метанола. Выпавший осадок ПГБ отделяли фильтрованием на воронке Бюхнера и высушивали при 105°С [10].
Содержание ПГБ в биомассе определяли обра-щенно-фазовой ВЭЖХ на колонке С18 [10, 13]. Для этого образцы сухой биомассы гидролизова-ли концентрированной H2SO4 при 100°С в течение 1 ч, затем гидролизат нейтрализовали 5 н. NaOH и центрифугировали 20 мин при 5000 g. Супернатант наносили на колонку и элюирова-ли смесью метанол-вода 1 : 1 со скоростью 0.4 мл/мин. Содержание ПГБ в элюатах определяли спектрофотометрически при 228 нм на УФ-детекторе UVIS 200 ("Linear", США), используя калибровочную кривую.
Молекулярную массу полимеров определяли вискозиметрическим методом, измеряя вязкость раствора ПГБ в хлороформе при 30°С [10], и рассчитывали ее значение по уравнению Марка-Хау-винка-Куна, используя коэффициент [п] = 7.7 х х 10-5 • М0 82 [17]. Температуру плавления, теплоту плавления и степень кристалличности ПГБ определяли методами дифференциального термического анализа на приборе TA-Q100 ("TA Instrument", США) и на рентгеноспектрометре D8 ADVANCE ("Bruker", Германия) соответственно [9].
Активность ферментов определяли, как описано ранее [17]. В таблицах приведены средние значения трех независимых экспериментов.
Электронная микроскопия. Для электронно-микроскопических исследований использовали клетки, выращенные в условиях лимитирования по азоту. Для получения ультратонких срезов клетки фиксировали в 2% -ном растворе глутаро-вого альдегида в 0.05 М какодилатном буфере, pH 7.2, в течение 1 ч при +4°С, трижды промывали тем же буфером, дополнительно фиксировали в том же буфере, содержащем 2% OsO4, в течение 4 ч при комнатной температуре, затем отмывали исходным буфером. После обезвоживания растворами этилового спирта (70, 80, 96, 100%) и 100% -ным ацетоном клетки заключали в эпоксидную смолу Epon-812. Ультратонкие срезы, полученные на ультратоме LKB III ("Uppsala", Швеция) монтировали на опорные сеточки, покрытые формваровой пленкой, и контрастировали 3%-ным раствором уранилацетата в 70%-ном этаноле в течение 30 мин, а затем окрашивали цитратом свинца в течение 4-5 мин при 20°С [12]. Полученные препараты просматривали в
f т
1 мкм I 1 1 мкм
(a) (б)
Рис. 1. Электронно-микроскопические снимки срезов клеток М. ех^щыет 010 (а) и М. НаШо1егат С2 (б) на стадии синтеза ПГБ.
70
^ 60 Б,
Г50 П
40
Р ¡20
о
И 10
0
(а) NaOH
(б)
* 50 Б,
Г
С 40
ч
„30 а,
с
Био10
NH
J_I_I_I_L
0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 ч
J-1-1-1-14 I A I A I
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 44 52 60 72
0.25 0.20 0.15 t 0.10 f 0.05 0
Рис. 2. Динамика накопления биомассы (1) и ПГБ (2) М. extoгquens 010 (а) и М. НаЬЫегат С2 (б) при различных концентрациях КИ+ (3).
0
ч
электронном микроскопе JEM 100 B ("Jeol", Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Культивирование штаммов. Розовоокрашен-ный ограниченно-факультативный метилотроф M. extorquens G10 не зависит от витаминов и других факторов роста. Напротив, M. halotolerans С2 является бесцветным облигатно-метилотрофным продуцентом ПГБ, В12-зависимым, хорошо растет на минеральной среде с метанолом и дрожжевым автолизатом (0.1%) как более дешевым заменителем витамина B12.
На электронно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.