ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 1, с. 69-76
УДК 579.22:582.282
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГРИБНОГО МЕЛАНИНА И ГУМИНОПОДОБНЫХ ВЕЩЕСТВ, СИНТЕЗИРУЕМЫХ
Cerrena maxima 0275
© 2007 г. О. В. Королёва*, Н. А. Куликова**, Т. Н. Алексеева***, Е. В. Степанова*, В. Н. Давидчик*, Е. Ю. Беляева**, Е. А. Цветкова****
*Институт биохимии им. АН. Баха РАН, Москва, 119071; e-mail: vdavidchik@gmail.com **Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, 119992 ***Всероссийский научно-исследовательский институт пивововаренной, безалкогольной и винодельческой
промышленности РСХАН, Москва, 119021 ****Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского, Москва, 117913 Поступила в редакцию: 10.01.2006 г.
Проведены сравнительные исследования грибного меланина и двух препаратов высокомолекулярных гуминоподобных веществ, образующихся при твердофазном культивировании базидиомицета Cerrena maxima 0275, в течение 45 и 70 сут. Грибной меланин из Aspergilus niger и препараты гуминоподобных веществ, синтезируемых базидиальным грибом C. maxima 0275, близки по физико-химическим свойствам (элементный состав, поведение в кислотах и щелочах) и ауксиноподобной активности. На структурном уровне эти биополимеры значительно отличаются друг от друга. По данным ИК-спек-троскопии, полученные гуминоподобные вещества имеют большее сходство с природными гумино-выми кислотами и более разнообразны по функциональным группам по сравнению с грибными меланинами. Предполагается, что это связано с участием в образовании гуминоподобных веществ лакка-зы, включающим не только синтез этих полимеров, но и их модификацию и деградацию.
Меланины - высокомолекулярные пигменты, синтезируемые растениями, грибами, бактериями и гельминтами [1-3], представляют собой полимеры фенольной и (или) индольной природы [4]. Исследования природы меланинов и особенностей их метаболизма показали полифункциональность данных соединений (фармакотерапевтические эффекты при лечении заболеваний различного гене-за), что поставило их в ряд перспективных компонентов при создании новых поколений лекарственных форм. Общепринято, что меланины играют роль универсальных протекторов у живых организмов при воздействии факторов мутагенной и канцерогенной природы на клеточном уровне. Однако в настоящее время нет единого мнения даже по содержанию самого термина меланины.
Согласно современной классификации, меланины делятся на две группы: эумеланины (нерастворимые черные и темно-коричневые пигменты) и феомеланины (растворимые в щелочах пигменты желто-красно-коричневого цвета). При этом различают два пути синтеза указанных групп меланинов [5], приводящих к принципиальным различиям в строении и свойствах эу- и феомеланинов. Общепринято, что эумеланины не могут быть предшественниками гуминовых веществ (ГВ) [6], в то время как пути превращений феомеланинов в окружающей среде и возможность их включения в ГВ не установлены. По физико-химическим свойствам и
структурным характеристикам феомеланины наиболее близки к гуминовым веществам, о чем свидетельствует их поведение в растворителях, особенности элементного состава, спектральные характеристики (оптические, инфракрасные и ЯМР-спектры) и низкое содержание полисахаридов [7, 8]. В отличие от эумеланинов, биосинтез феомеланинов микробного происхождения включает ряд ферментативных стадий, катализируемых фенолоксидазами (тирозиназы, лакказы и катехолазы), хотя возможны и другие пути синтеза. Для Cryptococcus neoformans установлено, что меланизация катализируется лакказой (КФ 1.14.18.1) [9], которая является продуктом одного гена (CNLAC1) [10]. Фитопатоген-ный аскомицет Gaeumannomyces graminis var. tritici синтезирует лакказу, участвующую в формировании меланиновых пигментов и деполимеризации лигнина, принадлежащего инфицированным растениям [11].
Лакказы и продуцирующие их базидиальные грибы в настоящее время широко используются в биотехнологиях утилизации лигнинсодержащих отходов и при рекультивации сред, загрязненных по-лихлорированными бифенилами (ПХБ), полиядерными ароматическими углеводородами (ПАУ), синтетическими красителями и пестицидами.
Исследования, направленные на идентификацию и изучение свойств гуминоподобных веществ (ГПВ), синтезируемых базидиомицетами являют-
ся актуальными. Нерешенной остается проблема положения ГПВ в ряду других природных полимеров, образующихся в сходных условиях, таких, как меланины и ГВ. Принимая во внимание мнение ряда исследователей [4], что уникальная полифункциональность меланинов вытекает из характера самого процесса их синтеза, можно рассматривать синтез ГПВ с участием лакказы как модель образования биополимеров с определенными свойствами (антиоксидантные, антимутагенные и антиканцерогенные).
Нашими предыдущими исследованиями было показано, что в синтезе ГПВ базидиальными грибами принимает участие лакказа [12]. Следовательно, сходство путей биосинтеза грибных ГПВ и грибных меланинов (феомеланинов) может быть обусловлено участием лакказы - внеклеточной оксидазы базидиомицетов. Анализируя данные литературы, можно сделать вывод, что главное отличие этих двух видов полимеров основано на источнике их происхождения, месте локализации и условиях образования. У грибов белой гнили, выращенных на средах с растительным субстратом, ГПВ образуются, главным образом, вне клетки, тогда как меланиновые пигменты, как правило, прочно связаны с клеточной стенкой. Следует подчеркнуть, что грибы белой гнили не относятся к активным продуцентам меланинов, но способны образовывать ГПВ из продуктов деградации лигнина. Таким образом, меланины и ГПВ имеют много общих черт: стохастичность, значительная гетерогенность структуры и высокая устойчивость к биодеградации, участие полифенолокси-даз, в частности лакказ, в их биосинтезе, а наиболее значительное отличие - их локализация.
Роль лакказы в процессе биосинтеза грибного меланина может быть оценена путем сравнения состава, свойств и биологической активности грибного меланина, в биосинтезе которого данный фермент не принимает участия [13] и продуцируемых грибами ГПВ, образуемых при непосредственном участии лакказы. В качестве объекта исследования был выбран грибной меланин, синтезируемый A. niger из ацетата с образованием в качестве промежуточного продукта 1,8-дигидроксинафталина без участия лакказы [14] и ГПВ, синтезируемые бази-диальным грибом Cerrena maxima 0275.
Цель работы - сравнительная характеристика грибного меланина из A. niger и ГПВ, синтезируемых базидиальным грибом C. maxima 0275 возбудителем "белой гнили", в процессе роста на лиг-нинсодержащем субстрате.
МЕТОДИКА
Получение гуминоподобных веществ. Базиди-альный гриб C. maxima 0275 (коллекция культур базидиомицетов Ботанического института им. В.Л. Ко-
марова РАН) выращивали твердофазным способом на овсяной соломе в качалочных колбах на 750 мл в стационарных условиях при 37°С в течение 45 и 70 сут, как описано ранее [15]. Среда для культивирования на соломе, вносимая в каждую колбу в количестве 50 мл, содержала CuSO4 [16] и не содержала глюкозы. В колбу вносили 30 мл гомогенизированного инокулята, полученного при поверхностном выращивании культур [16]. В процессе культивирования поддерживали 80%-ную влажность в колбах.
Выделение темноокрашенной фракции ГПВ проводили по описанной ранее методике [17]. После 45 и 70 сут выращивания в колбы, содержащие культуры грибов, заливали теплую (60°С) дистиллированную воду в количестве 150 мл на колбу и оставляли на 6 ч при постоянном перемешивании.
Далее жидкость фильтровали, отделяя солому с мицелием, с использованием бумажного фильтра. В фильтрат добавляли концентрированную HCl по каплям до рН 2.0. Раствор оставляли на 24 ч при 4°С, при этом выпадал хлопьевидный осадок бурого цвета. Осадок собирали центрифугированием при 7000 g в течение 30 мин, промывали дистиллированной водой, затем снова центрифугировали и диализовали против дистиллированной воды. Для диализа использовали мембраны с размерами пор, позволяющими отделить компоненты с молекулярной массой менее 6000 Да. Диализ проводили >24 ч и заканчивали при достижении диализуемого раствора рН 4.5. Диализованные препараты ГПВ, синтезированные базидиомицетом в течение 45 (ГПВ-45) и 70 (ГПВ-70) сут культивирования, высушивали в вакууме при -18°C в течение 12 ч. Препараты ГПВ представляли собой темно-окрашенный порошок.
Получение меланина из грибов. Меланин из Aspergillus niger был предоставлен профессором Б.Н. Огарковым (НИИ биологии при Иркутском государственном университете).
Предоставленный меланин был получен согласно общепринятой методике. Культивирование продуцента проводили согласно [6, 18] на минеральной среде, содержащей глюкозу, при 26°С до появления сильной пигментации мицелия. Мицелий отделяли фильтрованием, промывали дистиллированной водой и замораживали при -16°С. Мицелий подвергали щелочному гидролизу (0.1 M NaOH) с последующим осаждением концентрированной HCl. Полученный осадок центрифугировали при 7000 g в течение 30 мин, промывали дистиллированной водой, затем снова центрифугировали и диализовали против дистиллированной воды. Диализ проводили не менее 24 ч и заканчивали при достижении диализуемого раствора рН 4.5. Диализованный препарат грибного меланина (ГМ) высушивали при 40°C.
Элементный анализ. C,H,N,S-aHanH3 был выполнен на элементном анализаторе модели 1106 фирмы "Carlo Erba Strumentazione" (Италия). Содержание кислорода рассчитывали по разности между массой беззольной навески и суммарным содержанием С, Н, N. Зольность определяли сжиганием препарата в муфельной печи.
Определение молекулярной массы. Гель-хрома-тографическое определение молекулярной массы и обработку полученных хроматограмм проводили согласно [19]. В качестве фракционирующего геля использовали "Toyopearl-55 HW(S)" (Япония), размеры колонки составляли 20 мм X 25 см. Пробы ГПВ-45, ГПВ-70 и ГМ растворяли в 0.028 М фосфатном буфере (рН 6.8), который использовали в качестве подвижной фазы при проведении фракционирования. Концентрация ГПВ-45, ГПВ-70 и ГМ во фракционируемых пробах составляла 50 мг/л. Объем инжектируе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.