МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 2, с. 180-187
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 579.835.013:577.115.7
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ
и о-специфических полисахаридов Ахознтььим
БЯА81ЬЕ№Е 8р245 И ЕГО ОМЕГОН-Кт МУТАНТОВ КМ018 И КМ252
© 2004 г. Ю. П. Федоненко*, Э. Л. Здоровенко**, С. А. Коннова*1, В. В. Игнатов*, Г. В. Шляхтин***
*Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов
**Институт органической химии им. НД. Зелинского РАН, Москва ***Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Саратов
Поступила в редакцию 18.02.03 г.
Из внешней мембраны бактерий АгозртШт ЪтазИепзе Бр245 и омегон-Кш мутантов этого штамма (КМ018 и КМ252) экстракцией горячей водно-фенольной смесью выделены липополисахариды и исследован их химический состав. Обнаружены различия в содержании углеводов, глюкозамина, общего фосфора, а также в соотношении октадеценовой и гексадекановой кислот в липидных составляющих ЛПС. Выявлена гетерогенность углеводных компонентов ЛПС по заряду. Получены и охарактеризованы О-специфические полисахариды (ОПС) штамма Бр245 и его мутантов. На основании анализа ОПСКМ018 и ОПСКМ252 мутантных штаммов методами ГЖХ, ИК- и ЯМР-спектроско-пии показано, что они состоят из линейных пентасахаридных повторяющихся звеньев следующего строения: —► 2)-Р-Б-ЯЬар-(1 —- 3)-а-Б-ЯЬар-(1 —- 3)-а-Б-ЯЬар-(1 —- 2)-а-Б-ЯЬар-(1 —- 2)-а-Б-ЯЬар-(1 —»-, идентичных, ранее обнаруженным в ОПС штамма Бр245. Выявленные нами ранее различия в биологической активности ЛПС родительского и мутантных штаммов бактерий могут быть связаны с обнаруженными изменениями химического состава ЛПС.
Ключевые слова: липополисахариды, структура О-специфических полисахаридов, АгозртШит Ътasilense.
Бактерии рода Azospirillum широко распространены в почвах и вступают в ассоциативные взаимоотношения с корнями различных кормовых трав, злаков и других растений. Азоспириллы привлекают особое внимание исследователей благодаря тому, что входят в группу диазотрофных ризобакте-рий, стимулирующих рост растений.
Azospirillum brasilense - один из наиболее исследованных видов данного рода, преимущественно ассоциирован с корневой системой пшеницы [1]. Штамм A. brasilense Sp245 наиболее перспективен как для практического использования, так и для различного рода фундаментальных исследований из-за его способности к эндосимбиозу [2]. Среди макромолекул бактериальной поверхности, участвующих в реализации молекулярных механизмов формирования ассоциации растений и микроорганизмов, в частности азоспирилл, важную роль играют полисахаридсодержащие биополимеры [3, 4.]. Ранее нами были получены данные об участии ЛПС, непосредственно встроенных в мембрану азоспирилл или продуцирующихся в процессе жизнедеятельности в окружающий клетки капсульный слой, на ранних этапах колонизации
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: konnova@ibppm.sgu.ru).
бактериями корней растений-хозяев [4, 5]. Сотрудниками ИБФРМ РАН были получены и любезно предоставлены нам канамицинустойчивые мутанты бактерий А. ЪтавИепве Бр245 - штаммы КМ252 и КМ018, с инсерцией омегон-Кш в плаз-миде 120 мДа [6]. Наличие мутантов по синтезу ЛПС открывает широкие возможности для изучения роли ЛПС в процессах взаимодействия с корневой поверхностью растений при формировании ассоциаций со злаками. Мутанты были отобраны на основе иммунохимических тестов. В частности, авторы показали наличие "внешней и внутренней" полос преципитации в тесте двойной иммунодиффузии грубых экстрактов ЛПС исходного штамма Бр245. В то время как ЛПС-содер-жащие экстракты мутантов КМ252 и КМ018 обнаруживали либо только "внутреннюю", либо только "внешнюю" полосы преципитации соответственно. По данным тестов двойной иммунодиффузии и электрофореза авторы предположили, что мутации привели к нарушению синтеза в каждом случае одного из ОПС. Позже нами было показано снижение адсорбционной активности клеток А. ЪтавИепве КМ252 на корнях проростков пшеницы, а также уменьшение влияния ЛПС (двух мутантов КМ252 и КМ018) на морфологию
корневых волосков по сравнению с исходным штаммом - A. brasilense Sp245 [5]. Было высказано предположение о том, что причиной этого явились изменения, вызванные инсерцией омегона в плазмиду 120 мДа, произошедшие в ЛПС наружной мембраны A. brasilense Sp245, выявленные нашими коллегами иммунохимическими методами [6]. Однако для понимания механизмов действия и роли отдельных компонентов сложной молекулы ЛПС в биологической активности бактериальной мембраны иммунохимические исследования необходимо сочетать с выделением и химическим анализом индивидуальных препаратов бактериальных антигенов.
Целью данной работы явилось выделение и сравнительный анализ ЛПС и ОПС бактерий штамма A. brasilense Sp245 и его инсерционных мутантов КМ252, КМ018.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактериальные культуры. Бактерии Azospiril-lum brasilense Sp245, используемые в нашей работе, были выделены из поверхностно стерилизованных корней пшеницы [2] и любезно предоставлены нам доктором Dobereiner (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria, Rio de Janeiro, Бразилия). Канамицину-стойчивые мутанты этого штамма КМ252 и КМ018 с инсерцией омегон-Кт в плазмиде 120 мДa [7] получены от Е.И. Кацы (лаборатория генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН).
Условия культивирования, а также состав жидкой малатной питательной среды описаны нами ранее в работе [3]. В среду выращивания му-тантных культур добавляли сульфат канамицина до конечной концентрации 100 мкг/мл.
Выделение ЛПС и ОПС. С поверхности клеток отмывали капсульный материал раствором NaCl (0.15 M) с добавлением NaN3. Процедура удаления капсулы описана в работе [5]. Полноту удаления капсулы контролировали при помощи теста двойной иммунодиффузии с антителами на целые клетки азоспирилл, обработанные глута-ровым альдегидом. ЛПС выделяли из высушенных ацетоном бескапсульных клеток, как описано ранее [5] и деградировали 1%-ной уксусной кислотой (рН 2.8.) в течение 4 ч при 100°С. Фракцию ОПС выделяли хроматографией углеводной части на колонке (50 х 2.2 см, V0 = 40 мл) с гелем Sephadex G-50 ("Pharmacia", Швеция), используя в качестве элюента 0.05 М пиридин-ацетатный буфер (рН 4.1).
ОПС разделяли по заряду ионообменной хроматографией на аналитической колонке (20 х 1 см) с DEAE-Trisacryl М в 0.005; 0.01; 0.1; 0.25; 0.5 M натрий-фосфатном буфере (pH 6.3) и на препаративной колонке (20 х 2.3 см, V0 = 40 мл) с
DEAE-Toyopearl 650 M ("Toyo Soda", Япония). Элюцию осуществляли ступенчато: сначала буфером mpuc-HQ (0.01 M, pH 7.2), а затем раствором NaCl в том же буфере в градиенте концентраций от 0.01 до 1.0 M. Скорость элюции составляла 0.8 мл/мин. Полисахариды обессоливали на колонке c TSK-Gel HW-40, концентрировали на ротационном испарителе и лиофилизировали.
В случае гель-фильтрации детекцию материалов проводили с помощью дифференциального проточного рефрактометра LKB 2l42 (LKB, Швеция). При ионообменной хроматографии элюци-онные профили строили по углеводам - по оптической плотности продуктов реакции фракций с фенолом и серной кислотой, измеренной при длине волны 490 нм, и по белкам - по оптической плотности фракций при 280 нм. Измерения проводили на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, СССР).
Колориметрическое определение содержания в препаратах ЛПС углеводов, 2-кето3-дезоксиок-тоновой кислоты (КДО), белков, нуклеиновых кислот, фосфора проводили по традиционным методикам, описанным нами ранее [3].
Анализ метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) выполняли на газовом хроматографе Биохром-1 (СССР) с пламенно-ионизационным детектором, колонка (0.2 мм х 25 м ) с SE-54; температуру программировали в интервале от 150 до 250°C со скоростью 2.5°С/мин. Метилирование жирных кислот липидных составляющих ЛПС проводили в запаянных ампулах с 2 N Hd в метаноле при 84°С в течение 16 ч в соответствии с опубликованным методом [7]. Идентифицировали жирные кислоты по эталонным образцам фирмы "Sigma" (США).
Анализ нейтральных моносахаридов производили по содержанию ацетатов полиолов производных моносахаридов в гидролизатах в соответствии с методикой [8]. Использовали капиллярные колонки Ultra 2 (Hewlett-Packard, США). Анализ выполняли на хроматографе Hewlett-Packard 5890 в градиенте температуры от 180°С (1 мин) до 290°С со скоростью нагрева 10°С/мин. Относительное содержание сахаров представлено как соотношение площадей пиков по показаниям детектора прибора.
Абсолютную конфигурацию нейтральных сахаров устанавливали методом ГЖХ в виде ацети-лированных гликозидов с (Я)2-октанолом [9].
Содержание аминосахаров определяли на аминокислотном анализаторе ААА-339 (ЧССР).
ИК-спектры образцов ПС, запрессованных в таблетках KBr, снимали на спектрофотометре IR-75 с приставкой для микрообразцов ^arl Zeiss, ГДР).
Электрофорез препаратов ЛПС в полиакрила-мидном геле в денатурирующих условиях (в присутствии SDS) проводили по методу [10] при токе
3 4 5
4 I
А 6
Л 7
1 кж
Рис. 1. Иммунодиффузионный анализ концентрата отмывающего капсулу раствора: А - антитела на целые клетки А. ЬгаяИете Зр245, обработанные глута-ровым альдегидом; кж - культуральная жидкость; цифры соответствуют суткам отмыва.
40 мА в течение 3 ч. Концентрирующий гель содержал 5%, а разделяющий - 12.5% акриламида. Перед нанесением в лунки образцы нагревали при 100°С в течение 5 мин. Окрашивали гель азотнокислым серебром в соответствии с процедурой, предложенной в работе [11].
Для проведения ЯМР-спектроскопического исследования образцы лиофилизовали дважды из 99.9% Б20 и растворяли в 99.96% Б20. 1Н и 13С ЯМР-спектры записывали на спектрометре Вгик-ег БЯХ-500 (Германия) при 27°С. Химические сдвиги определяли с использованием ацетона как внутреннего стандарта (5Н 2.225, 5С 31.45). Спектры снимали, используя стандартное математическое обеспечение компании "Вгикег"; для сбора и обработки данных использовали программу Х"ШККМЯ 2.1. В экспериментах ТОСБУ и КОББУ время смешивания составляло 150 и 200 мс соответственно.
Результаты всех экспериментов подвергали статистической обработке. Доверительные интервалы даны для надежности 95%.
РЕЗУЛЬТА
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.