ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2008, № 2, с. 156-162
^ БИОЛОГИЯ
КЛЕТКИ
УДК 591.82:576.536:576.535.5
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ИЗ КОСТНОГО МОЗГА КРЫСЫ НА РАННИХ И ПОЗДНИХ ЭТАПАХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
© 2008 г. М. Н. Кожевникова, А. С. Микаелян, О. В. Паюшина, В. И. Старостин
Институт биологии развития им Н.К. Кольцова РАН, 119991 Москва, ул. Вавилова, 26 E-mail: mn_kozhevnikova@mail.ru Поступила в редакцию 07.06.2007 г.
Мезенхимная стромальная клетка является мультипотентным предшественником остеобластов, адипоцитов и ряда других клеток. Цель работы состояла в сравнительном анализе культур мезен-химных стромальных клеток из костного мозга крысы на ранних и поздних пассажах с применением молекулярно-генетических и цитологических методов. За 140 сут культура претерпела 11 пассажей. Показано, что при длительном культивировании мезенхимные стромальные клетки теряют потенции к адипогенной дифференцировке, при этом сохраняя способность к остеогенезу. Несмотря на минерализацию внеклеточного матрикса и экспрессию маркеров остеогенеза, на поздних сроках культивирования (9-й, 11-й пассажи) отсутствуют типичные морфологические признаки костной дифференцировки, наблюдаемые на ранних сроках культивирования (1-4-й пассажи). Сравнительный анализ пролиферативного потенциала мезенхимных стромальных клеток показал, что различия во времени удвоения популяции на ранних и поздних сроках культивирования незначительны. Практически полная остановка клеточного роста наблюдалась на 5-6-м пассажах
Мезенхимные стромальные клетки (МСК), впервые обнаруженные в составе стромы кроветворных органов (Фриденштейн, Лурия, 1980), обладают статусом мультипотентных родона-чальных клеток, т.е. способны давать начало адипогенной, остеогенной, хондрогенной и ряду других дифференцировок. В костном мозге человека и млекопитающих МСК составляют крайне малочисленную популяцию (0.01-0.001%), способную к адгезии к поверхности культурального пластика. Адгезия к пластику и другим субстратам служит критерием для выделения этих клеток и необходима для их пролиферации (БотшМ вг а1., 2006). Первоначально МСК рассматривались только как клетки стромы костного мозга, организующие кроветворное микроокружение. В настоящее время помимо костного мозга известны и иные источники МСК: жировая ткань, пупо-винная кровь, ряд эмбриональных тканей и др.
В официальном постановлении Международного общества клеточной терапии (Ботши вг а1., 2006) определены три минимальных критерия для МСК: адгезия к пластику в стандартных куль-туральных условиях, экспрессия поверхностных антигенов СБ90, СБ 105, СБ73 и наличие множественных потенций к дифференцировке.
Интерес многих исследователей к МСК обусловлен их широкими потенциями к дифференцировке и способностью поддерживать пролиферацию кроветворных стволовых клеток при ко-
трансплантации, что открывает перспективы для их использования в клеточной и генной терапии. Однако терапевтическое использование МСК требует значительного количества этих клеток, в связи с чем возникает необходимость наращивания клеточной массы путем длительного культивирования МСК in vitro. Кроме того, длительное культивирование МСК служит удобной экспериментальной моделью для исследования механизмов их самоподдержания, направленной дифференцировки и старения, что является одним из приоритетных направлений в биологии стволовых клеток.
Мультипотентные свойства МСК при длительном культивировании ослабевают. В частности, показано, что при прохождении культурой МСК 12 пассажей наблюдаются признаки старения клеток и потеря потенций к адипогенной дифференцировке (DiGirolamo et al., 1999). В исследованиях других авторов при культивировании МСК костного мозга человека в течение 10 пассажей способность к адипогенезу сохраняли лишь 2 из 5 культур, тогда как к остеогенезу -4 из 5 (Bonab et al., 2006). Сохранение потенций МСК к остеогенезу при длительном культивировании подтверждается рядом других исследований (Bruder et al, 1997; DiGirolamo et al, 1999; Mu-raglia et al., 2000). Необходимо отметить, что для стареющих культур характерно спонтанное на-
копление кальция во внеклеточном матриксе (Di-Girolamo et al., 1999).
Показано (Mets, Verdonk, 1981), что на ранних пассажах культура МСК гетерогенна и содержит, по крайней мере, два морфологически различных клеточных типа: медленно делящиеся крупные распластанные клетки и быстро делящиеся вере-теновидные. Напротив, на поздних пассажах культура более гомогенна и характеризуется преобладанием клеток первого типа (Prockop et al., 2001). Согласно другим экспериментальным данным, при длительном культивировании МСК (118 сут) в культуре наблюдается проявление феномена клеточного старения, получившего название феномена Хейфлика. Морфологические признаки феномена Хейфлика таковы: клетки начинают различаться по размеру и форме, цитоплазма приобретает выраженную зернистость, с множеством включений, в культураль-ной среде появляются клеточные обломки (Bonab et al., 2006).
Репликативное старение МСК во многом зависит от того, какой вид животного является их источником. Согласно имеющимся в литературе данным, МСК человека способны претерпевать 40-50 удвоений популяции (Stenderup et al., 2003), тогда как МСК мыши - более 100 удвоений (Meir-elles, Nardi, 2003). Пролиферативный потенциал МСК снижается с увеличением возраста донора клеток (D'Ippolito et al., 1999, Baxter et al., 2004), а также в процессе их многократного пассирования in vitro (DiGirolamo et al., 1999; Bonab et al., 2006).
Однако для более полного суждения о роли многократного пассирования в старении культуры МСК необходимо как можно более детальное изучение молекулярных и цитологических аспектов изменения мультипотентного статуса МСК при их долговременном культивировании in vitro. Поэтому целью настоящей работы было проведение сравнительного анализа культур МСК крысы на ранних и поздних сроках культивирования с помощью цитологических и молекулярно-генетических методов анализа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Получение и культивирование МСК крысы. В работе использовали неинбредных крыс Wistar в возрасте 5-6 мес. и весом 120-150 г. Бедренные и большеберцовые кости иссекали, освобождали от мягких тканей и после отсечения эпифизов вымывали содержимое диафизов средой a-MEM (Sigma, США) с помощью шприца объемом 10 см3. Полученные образцы костного мозга суспендировали с помощью шприца и пропускали через капроновый фильтр. После подсчета числа клеток суспензию (5 х 106 кл./мл) помещали в культуральные флаконы площадью 75 см2 (Grein-
er, Германия) и культивировали по стандартной методике в ОД^нкубаторе при 37°С с 5% CO2, используя ростовую среду a-MEM без дезоксири-бонуклеотидов и рибонуклеотидов с добавлением 2 мМ L-глютамина (Sigma), 10% сыворотки плодов коровы (Биолот, Россия), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Спустя 24 ч после посева первичной культуры неадгезивные клетки удаляли, а адгезивные дважды промывали фосфатным буфером (PBS), модифицированным Дульбекко (Sigma), pH 7.2-7.4 и проводили смену среды. В дальнейшем среду меняли каждые 3-4 сут в течение 14-15 сут.
При достижении клетками 90-100%-ной кон-флуентности их снимали с помощью 0.25%-ного раствора трипсина (Биолот) в 1 мМ этилендиамин-тетрауксусной кислотой (ЭДТА), рассеивали по культуральным флаконам (3 х 104 кл./мл) и продолжали культивировать в среде a-MEM с 8% сыворотки плодов коровы без добавления антибиотиков до очередного достижения 90-100%-ной конфлуентности. Общая продолжительность культивирования составила около 140 сут, в течение которых культура претерпела 11 пассажей.
Индукция остеогенной и адипогенной дифферен-цировки МСК. МСК в концентрации 2000 кл./см2 высеивали в культуральные флаконы площадью 25 см2 (Greiner) для выделения тотальной РНК и в 12-луночные платы (площадь одной лунки 3.83 см2) (Greiner) для иммуноцитохимического и гистохимического анализов. Для индукции остео-генеза клетки культивировали в ростовой среде с добавлением 108 M дексаметазона, 50 мкг/мл фосфата аскорбиновой кислоты и 10 мМ Р-глице-рофосфата в течение 15-18 сут, меняя среду на свежеприготовленную каждые 3-4 сут. Для визуализации минеральных отложений во внеклеточном матриксе клетки промывали PBS, фиксировали ледяным 70%-ным этанолом в течение 1 ч, промывали дистиллированной водой и окрашивали раствором ализаринового красного S, pH 4.1 (Sigma) в течение 10 мин, после чего дважды отмывали PBS и докрашивали ядра гематоксилином.
Для индукции адипогенеза клетки культивировали в ростовой среде c добавлением 106 М дексаметазона, 0.5 yM 3-изобутил-1-метилксантина и 0.01 мг/мл инсулина в течение 14 сут. Среду меняли каждые 3-4 сут. Появление клеток с жировыми включениями контролировали в течение всего срока культивирования с помощью фазово-кон-трастного микроскопа с фотокамерой Olympus AH-3 (Германия). Мультилокулярные адипоциты появлялись через 14 сут культивирования. Для визуализации жировых включений клетки фиксировали смесью кальций-формол в течение 1 ч, затем 1 ч промывали водопроводной водой, споласкивали дистиллированной водой и 60%-ным
Праймеры, использованные в работе
Ген Нуклеотидная последовательность праймера Размер продукта, н.п. Температура отжига (^а), °С Количество циклов ПЦР-реакции
ß-actin 5' tacaacctccttgcagctcc 3' 598 60 30
5'ggatcttcagaggtagtctgtc 3'
OC 5' agactccggcgctacctcaa 3' 273 57 35
5' cagctgtgccgtccatactttc 3'
Runx2 5' ccgcacgacaaccgcaccat 3' 289 57.5 35
5' cgctccggcctacaaatctc 3'
CD90 5' gaacccagtcatcagcatcac 3' 496 55 30
5' gggcccaaccagtcacagag 3'
изопропанолом и окрашивали раствором жирового красного О в изопропаноле (Пирс, 1962). Гистохимическую реакцию анализировали с помощью фазово-контрастного микроскопа.
Иммуноцитохимия. При изучении остеоген-ной дифференцировки использовались монокло-нальные антитела к компоненту внеклеточного матрикса коллагену 1-го типа (Sigma) с разведением 1 : 4000. При изучении мультипотентного статуса МСК были использованы моноклональ-ные антитела к CD90 (Abcam, Великобритания) с разведением 1 : 50.
МС
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.