Биологические науки Физико-химическая биология
Биохимия
Бызова Н.А., старший научный сотрудник
Сафенкова И.В., кандидат биологических наук, научный сотрудник Жердев А.В., кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник Дзантиев Б.Б., доктор химических наук, зам. директора
(Институт биохимии им А.Н. Баха Российской академии наук)
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НАНОЧАСТИЦ КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА РАЗНОГО ДИАМЕТРА КАК НОСИТЕЛЕЙ И МАРКЕРОВ В ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ
Проведены сравнительные экспериментальные исследования конъюгатов антител с частицами коллоидного золота разного размера. Проведено сравнение функциональных свойств конъюгатов антител с частицами коллоидного золота (от 5 до 30 нм) на мембранах разной пористости, используемых в иммунохроматографии. Определены кинетические зависимости сигнала в аналитической зоне иммунохроматографической тест-системы от размера частиц коллоидного золота и пористости мембраны. Определены оптимальные сочетания размеров коллоидного носителя с иммунохро-матографическими мембранами.
Ключевые слова: мембраны, метод иммунохроматографии, тест-системы, биоматериал, реагенты.
A COMPARATIVE ANALYSIS OF COLLOIDAL GOLD NANOPARTICLES OF VARIOUS DIAMETERS AS CARRIERS AND MARKERS IN IMMUNOCHROMATOGRAPHIC ASSAY
Comparative experimental research of antibody conjugates with colloidal gold particles of various sizes was conducted. Comparison of various functional properties of antibody conjugates with colloidal gold particles (5-30 nm) was conducted on various porosity membranes used in immunochromatography. Kinetic dependencies of signal in the analytic area of immunochromatographic test system on the size of colloidal gold particles and the porosity of membrane were identified. Optimal combinations of the colloidal carrier's size and immunochromatographic membranes were detected.
Keywords: membranes, immunochromatographic method, test systems, biomaterial, reagents.
Введение
В настоящее время метод иммунохроматографии широко используется в стационарных медицинских и других лабораториях, а также во внелабораторных условиях для тестирования проб сыворотки крови, мочи, других видов биоматериала, сельскохозяйственной продукции, кормов, продуктов питания, объектов окружающей среды с целью выявления и/или оценки содержания соединений разных классов [1, 2]. Конкурентные преимущества иммунохроматографии определяются методической простотой, экспрессностью и производительностью этого метода. Иммунохроматографические тест-системы применяются для самых разных целей, включая выявление гормонов, наркотиков, антибиотиков, токсинов, маркеров
62
инфаркта, онкогенов, возбудителей инфекционных заболеваний и антител против этих возбудителей, а также многих других соединений.
Иммунохроматографический анализ основан на использовании мембранных носителей, на которые в определенных зонах нанесены иммунореагенты - антитела и их конъюгаты с окрашенными или генерирующими окрашивание метками, способные взаимодействовать с детектируемым соединением. В качестве меток в этих системах используют ферменты, окрашенные латексы, флуорофоры, но в большинстве случаев - коллоидное золото (КЗ) [3]. Известны разнообразные методики получения КЗ, основанные как на синтезе коллоидных частиц из солей золота с использованием химических восстановителей, так и на дезинтеграции металлического золота [4-6]. Особое внимание к КЗ в качестве метки связано с его уникальными оптическими свойствами, обусловленными поверхностным плазмонным резонансом [7-9]. Оптические свойства КЗ определяются размерами и формой частиц [9], поэтому их характеристики влияют использование препаратов КЗ в иммунохроматографии [4, 10].
КЗ в иммунохроматографии является носителем специфических реагентов - антител. Комплекс КЗ с антителами называется конъюгатом. Большой отрицательный заряд поверхности частицы золота - основа прочного адсорбционного взаимодействия с высокомолекулярными соединениями.
Иммунохроматографическая тест-система - это мультимембранный композит, обычно изготовляемый в виде тест-полоски. Он состоит из аналитической мембраны с реагентами, иммобилизованными в аналитической и контрольной зонах, и вспомогательных мембран, которые используются для размещения конъюгата специфических антител против определяемого соединения с КЗ, впитывания пробы и обеспечения потока жидкости вдоль композита при проведении анализа. В аналитической и контрольной зонах наносятся, соответственно, специфические антитела против определяемого соединения и антивидовые антитела. Данные о связывании метки в аналитической зоне используются для характеристики наличия и содержания в пробе определяемого соединения, данные о связывании метки в контрольной зоне - для оценки подтверждения сохранения тест-системой своих функциональных свойств.
К сожалению, на сегодня отсутствуют сравнительные экспериментальные исследования конъюгатов антител с частицами КЗ разного размера, а рекомендации производителей реагентов для иммунохроматографических тест-систем носят эмпирический характер [11]. Исходя из этого, задачей исследования было сравнение свойств конъюгатов антител с частицами КЗ разного размера (от 5 до 30 нм) при проведении иммунохроматографии на мембранах разной пористости и выбор на основании этого исследования наиболее подходящей комплектации для тест-систем.
Материалы и методы
Реактивы. В работе использовали поликлональные антитела козы против IgG человека (GAHIss) и кролика против IgG козы (RAGIss), иммуноглобулин класса G человека («Им-тек», Россия), трис, Тритон Х-100, азид натрия, танниновую кислоту («Sigma», США), золо-тохлористоводородную кислоту («Fluka», Германия), Твин-20, бычий сывороточный альбумин (БСА), цитрат натрия («MP Biomedicals», Великобритания), поливинилформаль, фос-форно-вольфрамовую кислоту («SPI Supplies», США), глицерин, NaCl, K2CO3 («ДиаэМ», Россия), Na2CO3, NaHCO3, KH2PO4, KOH («Химмед», Россия). Все вспомогательные реагенты (соли, кислоты, щелочи, органические растворители) были аналитической или химической чистоты. Растворы для получения КЗ и его конъюгатов готовили на воде, деионизиро-ванной с помощью установки Milli-Q («Millipore», США).
Для изготовления иммунохроматографических тест-полосок использовали мембраны из набора mdi Easypack («Advanced Microdevices», Индия), включавшего рабочую мембрану (CNPF-5^, CNPF-8^, CNPF-Шд или CNPC-15^), закрепленную на твердой пластиковой основе, стекловолоконную подложку для коллоидного конъюгата PT-R5, мембрану для нанесения
63
пробы GFB-R4, конечную адсорбирующую мембрану AP045 и защитную ламинирующую пленку на клейкой основе МТ-1.
Получение коллоидного золота с диаметром частиц 5 нм (НКЗ-1) [12]. К 79,0 мл деи-онизованной воды добавляли 1,0 мл 1% HAuCl4 и нагревали смесь до 60оС. К 15,0 мл деио-низованной воды добавляли 4,0 мл 1% цитрата натрия, 0,5 мл 1% танниновой кислоты, 0,5 мл 25 мМ К2СО3 и также нагревали смесь до 60оС. Смеси объединяли, нагревали до кипения и кипятили при слабом перемешивании с использованием обратного холодильника до полного восстановления золотохлористоводородной кислоты и получения стабильного, не изменяющего цвет коллоидного раствора. Затем смесь охлаждали до комнатной температуры.
Получение коллоидного золота с диаметром частиц 10 нм (НКЗ-2) [8]. 93,0 мл деио-низированной воды доводили до кипения, добавляли 6,0 мл 1% цитрата натрия и кипятили 5 мин. После этого при интенсивном перемешивании быстро добавляли 1,0 мл 1% HAuCl4, кипятили еще 15 мин и охлаждали до комнатной температуры.
Получение коллоидного золота с диаметром частиц 15 нм (НКЗ-3) и 30 нм (НКЗ-4) [8]. К 95,0 мл деионизированной воды добавляли 1,0 мл 1% HAuCl4. Смесь доводили до кипения, при перемешивании добавляли 4,0 мл 1% цитрата натрия, кипятили 15 мин и охлаждали до комнатной температуры.
Методика синтеза К3-30 отличалась тем, что использовали 97,5 мл деионизированной воды и 1,5 мл 1% цитрата натрия, а реакционную смесь кипятили в течение 30 мин.
Препараты КЗ хранили при +4-6оС.
Просвечивающая электронная микроскопия. Препараты КЗ в разведениях, соответствующих А520 = 1,0, наносили на медные сеточки (300 меш., «Pelco International», США), покрытые пленкой из растворенного в хлороформе поливинилформаля. Снимки получали на электронном микроскопе CX-100 («Jeol», Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Фотографии в цифровой форме анализировали с использованием программы UTHSCSA Image Tool («UTHSCSA Dental Diagnostic Science», США).
Получение конъюгатов антител с коллоидным золотом. Выбор концентрации антител при конъюгации с КЗ проводили по рекомендациям Hermanson [10], предусматривающим регистрацию поглощения при 580 нм после добавления к коллоиду антител и 10% NaCl. С этой целью к 0,1 мл растворов антител GAHIss в воде; концентрацию варьировали от 5 до 250 мкг/мл) добавляли по 1,0 мл КЗ (А520 = 1,0), перемешивали и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Затем в каждую пробу добавляли по 0,1 мл 10% NaCl, перемешивали и через 10 мин измеряли А580. Определяли точку выхода полученной зависимости (флоку-ляционной кривой) на плато и выбирали для конъюгирования концентрацию антител, на 10-15% превышающую эту величину.
Перед конъюгированием с КЗ антитела диализовали против 1000-кратного объема 10 мМ трис-HCl буфера, рН 9,0, в течение 2 ч при 4оС. К КЗ (А520 = 1,0) добавляли 0,1 М К2СО3 до достижения рН 9,5, после чего вносили в раствор антител выбранной концентрации. Смесь инкубировали 45 мин при комнатной температуре и перемешивании, затем добавляли БСА до конечной концентрации 0,25%. Частицы КЗ с иммобилизованными на них антителами отделяли центрифугированием при 8.000 g в течение 30 мин. После удаления супернатанта осадок ресуспендировали в 50 мМ К-фосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 0,1 М NaCl (ФБС) с добавлением 0,05% БСА и 0,05% Твин-20. При необходимости длительного хранения к полученному продукту добавляли также азид натрия до конечной концентрации 0,02%.
Изготовление иммунохроматографических тест-систем. На автоматическом диспен-сере IsoFlow («Imagene Technology», США) н
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.