ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 2, с. 151-160
УДК 579.23
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СВОБОДНОЖИВУЩИХ УЛЬТРАМЕЛКИХ БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПРИРОДНЫХ БИОТОПОВ
© 2015 г. Н. Е. Сузина*, Т. З. Есикова*, Р. Р. Олейников*, А. Б. Гафаров*, А. П. Шорохова*, В. Н. Поливцева*, Д. В. Росс*, Т. Н. Абашина*, В. И. Дуда*, **, А. М. Боронин*, **
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Московской обл., 142290
e-mail: suzina_nataliya@rambler.ru **Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино Московской обл, 142290
e-mail: kaistia@gmail.com Поступила в редакцию 22.05.2014 г.
Из различных экстремальных природных биотопов (грунта вечной мерзлоты, нефтешлама, почв, озерного ила, мхов термальных болот и кожных покровов шпорцевой лягушки Xenopus laevis) выделены 50 штаммов свободноживущих ультрамелких бактерий с объемом клеток от 0.02 до 1.3 мкм3. Из них 24 изолятов с размерами клеток <0.1 мкм3 и генома от 1.5 до 2.4 Mb были отнесены к категории ультрамикробактерий, которые принадлежат к различным филогенетическим группам (Al-phaproteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria) и родам (Kaistia, Chryseobacterium, Microbacterium, Leucobacter, Leifsonia и Agrococcus) домена Bacteria и являются свободноживущими мезофильными гетеротрофными аэробными бактериями. Представители родов Kaistia и Chryseobacterium были способны к факультативному паразитизму на других видах хемоорганотрофных бактерий и цианобакте-рий. Ультрамикробактерии различались по морфологии, ультраструктурной организации клеток и физиолого-биохимическим свойствам. По тонкому строению клеточных стенок изоляты разделялись на две группы: грамположительные и грамотрицательные формы.
Ключевые слова: ультрамикробактерии, нанобактерии, ультраструктура клеток, межмикробный паразитизм.
БОТ: 10.7868/8055510991502021Х
В настоящее время к ультрамикробактериям (УМБ) относят виды домена Bacteria, клетки которых в пролиферирующих культурах обладают объемом менее 0.1 мкм3 и малым размером генома (от 3.2 до 0.58 Mb) [1, 2]. В качестве синонима УМБ иногда используется термин нанобактерии (НБ).
В литературе приводятся многочисленные экспериментальные данные, свидетельствующие о существовании и широком распространении в природе ультрамелких форм бактерий с объемом клеток около 0.1 мкм3, то есть близким к теоретически рассчитанному минимальному размеру клеток [1—8]. Имеются свидетельства того, что УМБ являются составной частью микробных сообществ многих природных экосистем. Несколько десятков видов УМБ выделены из различных природных мест обитания: морской воды, почвы, ила, льдов Гренландии, грунтов вечной мерзлоты, кишечника человека и насекомых. Они культивируются in vitro на питательных средах и характеризуются разнообразием морфологии, ультраструктурной организации, физиологии и биохимии [2].
У представителей второго домена прокариот — АгеНава, также существуют ультрамелкие формы -ультрамикроархеи (УМА), в том числе — наноар-хеи, представители рода ЫапоагеНавыш, с клетками объемом менее 0.1 мкм3 [9].
Однако таксономическое, физиолого-биохи-мическое разнообразие и экологическая роль УМБ еще мало исследованы, что обусловлено методическими трудностями изучения данных организмов [10], а именно, пределами разрешения светового микроскопа (~0.2 мкм), а также характерным для УМБ медленным развитием колоний [5, 9]. По этой причине выделение и описание нового вида УМБ можно характеризовать как значительное открытие. Очевидно, что для изучения этого мира микроорганизмов необходимы специальные как методологические подходы, так и лабораторное оборудование.
Цель работы — выделение из различных экстремальных биотопов новых изолятов свободно-живущих УМБ и сравнительная характеристика их фенотипических и генотипических свойств.
МЕТОДИКА
В качестве источников выделения бактерий использовали: грунт вечной мерзлоты возрастом 1—3 млн лет (Восточная Сибирь, р. Чукочья) [11]; нефтешлам, возрастом более 35 лет, отобранный на полигоне Нижнекамского нефтекомбината (Нижнекамск, Россия); ил озера Байкал и очистных сооружений г. Пущино (Московская обл.); смыв с кожных покровов шпорцевой лягушки Xe-nopus laevis; мхи термального болота и почва возле термального источника (Камчатка, кальдера Узон, Россия); ризосфера кукурузы и ризосфера растения Pedilanthus tithymaloides [8]. Грунт вечной мерзлоты и нефтешлам были взяты для изучения, так как ранее с помощью прямой электронной микроскопии в них было обнаружено значительное количество ультрамикроклеток [11—13].
Для высевов на плотные питательные среды использовали три варианта подготовки образцов:
а) получение суспензий илов, грунтов, ризо-сферной почвы, смыва с кожи лягушки путем разведения проб и их фильтрации через мембранные поликарбонатные фильтры с порами 0.4 мкм (Millipore, США);
б) получение супернатантов из суспендированных образцов центрифугированием при 10000 g в течение 15 мин;
в) отбор проб путем прицельного микроскопи-рования образцов (метод подробно описан в работе [7]). Пробы грунтов, почв и илов перед приготовлением суспензий подвергали обработке по Д.Г. Звягинцеву [15].
Пробы высевали на поверхность следующих агаризованных сред.
а) Триптон-соевая среда 5/5 (г/л): экстракт сои — 30, гидролизат казеина — 5, дрожжевой экстракт — 1 и аминопептид — 60 мл/л, pH 8.0.
б) Синтетическая среда М9 (г/л): Na2HPO4 • • H2O - 6.0, KH2PO4 - 3.0, NaCl - 0.5, NH4Cl - 1.0, 1M MgSO4 - 1мл, 0.01 M CaCl2 - 10 мл; рН 7.2 доводили раствором 3 М NaOH. При приготовлении плотной среды добавляли 20 г/л агара и 50 мг/л дрожжевого экстракта в качестве источника витаминов.
в) Агаризованная среда с нефтешламом, включающая 30 г сырого нефтешлама, 6 г агара, 100 мг дрожжевого экстракта и 300 мл водопроводной воды.
г) Почвенная среда, содержащая 30 г дерново-луговой почвы, 6 г агара, 100 мг дрожжевого экстракта и 300 мл водопроводной воды.
Присутствие в составе триптон-соевой среды растительных белков сои и пептидов определяло ее преимущество по сравнению с мясо-пептон-ным агаром (МПА), содержащим животные белки,
и позволило выделить новые формы микроорганизмов [7, 8]. Использование почвенных сред также позволяло увеличивать многообразие культивируемых новых форм микроорганизмов [14]. Выращивание проводили при 25°С.
Чистые культуры изолятов получали путем
3—5 кратных пересевов. Оценку чистоты культур по однородности популяций и отсутствию в них клеток с другой морфологией проводили микроскопически на фазово-контрастном и электронном микроскопах. Размеры клеток определяли как с помощью фазово-контрастного, так и электронного микроскопа. Средний объем клетки рассчитывали, используя уравнения, приведенные в работе [16].
Литическую активность культуральной жидкости (КЖ) штаммов УМБ, отделенной от клеток центрифугированием (10000 g, 15 мин), определяли луночно-диффузным методом.
Способность к эпибиозу у штаммов УМБ определяли по адсорбции клеток УМБ на бактериях-жертвах и лизису клеток тест-организмов, используя фазово-контрастную, флюоресцентную и электронную микроскопию. Для испытания антагонистической активности были использованы в качестве тест-культур грамотрицатель-ные бактерии Pseudomonas putida BS394, Escherichia coli C 600, Erwinia herbicola ATCC 27155, Acidovorax delafieldii 39 и грамположитель-ные — Bacillus subtilis АТСС 6633, Micrococcus luteus ВКМ Ас-2230, Staphylococcus aureus 209-Р, а также некоторые виды цианобактерий. Ранее было показано, что штаммы бактерий B. subtilis АТСС 6633 и A. delafieldii 39, а также цианобактерии Chlorogloeopsis fritschii ATCC 27193 могут быть использованы в качестве теста на эпибиоз и бактериальный экзопаразитизм [7, 8, 17].
Влияние концентрации соли на рост ультра-микробактерий изучали на среде 5/5 с добавлением 0—10% NaCl при рН 7.0—7.2. Для изучения влияния рН среды на рост бактерий клетки выращивали на той же среде в диапазоне рН от 4.5 до 11.0. Соответствующие значения рН устанавливали добавлением 3 М NaOH или 1 М HCl. Прирост биомассы оценивали по изменению оптической плотности культуральной жидкости при 590 нм.
Для определения оптимальной температуры роста бактерии УМБ культивировали в жидких полноценных средах в диапазоне температур
4—45°C в течение 10—15 сут, ежесуточно измеряя оптическую плотность культур при 590 нм (кювета 5 мм) на спектрофотометре КФК-2 (Россия).
В качестве различных источников углерода и энергии использовали вещества, перечисленные в табл. 3, которые вносили в минеральную среду М9 в количестве 0.3% (вес/об.) или 0.5% (об./об.). Среду
инокулировали соответствующей культурой и инкубировали 14 сут на качалке (180 об/мин) при 240С или 290С. Рост бактерий оценивали по изменению оптической плотности культуры при 590 нм.
Для определения спектра утилизируемых субстратов и выяснения биохимических особенностей исследуемых штаммов использовали также Api-тесты (Api 20E, Api 20 NE) ("Biomerieux", Франция).
Для определения в клетках плазмидной ДНК использовали модифицированный метод Экхардта [18]. Содержание Г + Ц (мол. %) в ДНК определяли методом термической денатурации.
Систематическое положение штаммов определяли на основе следующих данных: наличие или отсутствие наружной мембраны, характерные физиологические и биохимические признаки, а также максимальный процент сходства нуклео-тидных последовательностей гена 16S рРНК с использованием базы данных GeneBank Национального центра биотехнологической информации США (NCBI).
Размеры геномов выделенных штаммов УМБ определяли методом, описанным в работе [8]. Хромосомную ДНК, иммобилизованную в агаро-зе, выделяли согласно протоколу "FIGE Mapper. Instruction Manual and Application Guide" ("BioRad", США). Для рестрикции хромосомной ДНК использовали 29 ферментов ("Fermentas", Литва), узнающих последовательность из 6 или 8 пар нук-леотидов (п. н.). Из этого набора ферментов были отобраны два — NheI и Spei, дающие наименьшее количество рестрикционных фрагментов. Размеры небольших фрагментов ДНК (от 5 до 150 т. п. н.) определяли с помощью инверсионного электрофореза (FIGE Mapper, "Bio
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.