научная статья по теме СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ОЛИГОХИТОЗАНОВ В ОТНОШЕНИИ KLEBSIELLA PNEUMONIAE Химия

Текст научной статьи на тему «СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ОЛИГОХИТОЗАНОВ В ОТНОШЕНИИ KLEBSIELLA PNEUMONIAE»

Ш

БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 1, с. 67-73

УДК 547.995.12:577.152.32:579.852.11

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ОЛИГОХИТОЗАНОВ В ОТНОШЕНИИ KLEBSIELLA PNEUMONIAE

© 2015 г. С. Н. Куликов*, **, #, В. Е. Тихонов***, Е. А. Безродных***, С. А. Лопатин ****, В. П. Варламов****

*Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора,

420015, Казань, ул. Большая Красная, 67 **Казанский федеральный университет ***Институт элементоорганических соединений им А.Н. Несмеянова РАН, Москва ****Центр "Биоинженерия"РАН, Москва Поступила в редакцию 06.05.2014 г. Принята к печати 17.06.2014 г.

В отношении Klebsiella pneumoniae исследована антибактериальная активность узкодисперсных образцов олигохитозанов, различающихся по молекулярной массе, при различных значениях рН. Благодаря использованию буферной системы на основе органических кислот впервые установлено, что при увеличении рН среды выше 7.0 зависимость антибактериальной активности от молекулярной массы полимера претерпевает инверсию. Показано, что в кислых условиях более сильное инги-бирующее действие характерно для образцов с большей молекулярной массой, а в слабощелочных условиях более активны формы хитозана, близкие к олигомерным. Предполагается, что антибактериальная активность хитозана определяется степенью протонирования его аминогрупп, которая является переменной величиной и зависит как от степени полимеризации вещества, так и значения рН среды. Полученные данные позволяют отчасти объяснить противоречивые сведения в литературе о взаимосвязи антибактериальной активности с молекулярной массой хитозана.

Ключевые слова: хитозан, олигохитозан, антибактериальная активность, Klebsiella pneumoniae.

Б01: 10.7868/80132342315010108

ВВЕДЕНИЕ

Хитозан — сополимер глюкозамина и ацети-лглюкозамина — является продуктом дезацетили-рования хитина, который содержится в экзоске-летах ракообразных и насекомых, гладиусах кальмара, клеточных стенках грибов и некоторых водорослей. Хитозан является единственным положительно заряженным полимером (поликатионом) естественного происхождения, который получают в больших количествах с высокой степенью химической чистоты, и, что немаловажно, обладающего умеренной стоимостью [1]. Мировое количество хитина оценивается на уровне 1010 тонн, что, учитывая постоянный биосинтез, делает его неистощимым источником для получения хитозана.

В последние два десятилетия значительно возрос интерес к биоцидным свойствам хитозана,

Сокращения: MES — морфолинэтансульфоновая кислота), ACES — ^-(2-ацетамидо)-2-аминоэтансульфоновая кислота; TES — ^-[трис(гидрокиметил)метил]-2-аминометансульфо-новая кислота); МИК — минимальная ингибирующая концентрация.

# Автор для связи (тел.: +7 (843) 238-99-79; факс: +7 (843) 236-67-21; эл. почта: kuliks@yandex.ru).

которые наряду с нетоксичностью, биосовместимостью, гипоаллергенностью и биодеградируе-мостью, позволяют использовать его в биомедицинских целях в качестве альтернативы и/или вспомогательного вещества в антимикробной терапии, особенно по отношению к ряду бактериальных штаммов, резистентных к классическим антибиотикам [2].

В литературе можно найти большое количество публикаций, посвященных изучению биоцидных свойств хитозана в отношении грамположительных бактерий, таких как стафилококки [3—7] и бациллы [8, 9], в отношении грамотрицательных бактерий, в числе которых кишечная палочка [3, 6—11], псевдомонады [2, 10] и сальмонеллы [9, 10]. Гораздо более ограниченными являются сведения об антибактериальной активности хитозана в отношении Klebsiella pneumoniae, среди которых можно отметить работу по исследованию ультраструктуры клеток под действием хитозанового полимера [4], и практически отсутствуют данные о влиянии на данный вид бактерий хитозанов, различающихся молекулярной массой.

Вместе с тем, клебсиеллы являются одной из главных групп бактерий, которые становятся причиной инфекционных заболеваний человека, характеризующихся тяжелым течением, а нередко и летальным исходом [12]. В структуре основных кишечных инфекций клебсиеллез составляет до 20%, доходя в отдельные годы в некоторых местностях до половины всех случаев данного типа заболевания. Особое значение клебсиеллезная кишечная инфекция имеет у новорожденных и детей раннего возраста, доходя до двух третей всех острых кишечных инфекций [13]. При этом все более серьезной проблемой антибактериальной терапии при дисбактериозах становится широкое распространение полирезистентных штаммов среди энтеробактерий [14].

Поэтому является актуальным проведение исследования биоцидных свойств хитозанового полимера в отношении К. pneumoniae — вида, наиболее часто (более 85% случаев) вызывающего инфекционные заболевания среди всех представителей данного рода [13]. Кроме того, остается нерешенной проблема установления взаимосвязи антибактериального действия хитозана с его молекулярно-массовыми характеристиками.

Дело в том, что, несмотря на большое количество экспериментальных работ, посвященных антимикробной, а также противогрибковой активности хитозана [2—11, 15—18], остается до конца невыясненной взаимосвязь между химической структурой хитозана как полимера и его биологическим эффектом на клетки микроорганизмов. Установление подобной взаимосвязи осложняется тем, что практически доступные препараты хи-тозана представляют собой гетерогенный набор молекул, различающихся по молекулярной массе, степени дезацетилирования, расположению остаточных ацетилированных звеньев вдоль полимерной цепи, вязкости и значению средней величины рКа.

Экспериментально установлено, что биоцид -ная активность хитозана прежде всего определяется его поликатионной природой [11, 19]. Поэтому антимикробная активность хитозана усиливается при увеличении степени дезацетилирования полимера, а также при повышении уровня кислотности среды, когда свободные аминогруппы приобретают положительный заряд [11, 20]. Однако до сих пор остаются противоречивыми сведения о влиянии молекулярной массы хитозана на его антимикробный эффект [21]. Отмеченное усиление антибактериального действия при увеличении молекулярной массы хитозана может быть связано с тем, что увеличение количества аминогрупп в молекуле приводит к более прочному связыванию полимера с поверхностными структурами клетки, большей степени агглютинации клеток [6, 11]. С другой стороны, усиление антибактери-

ального действия при уменьшении молекулярной массы хитозана может быть связано с тем, что низкомолекулярный хитозан, а также его олиго-меры способны более активно проникать через клеточную стенку бактерий, взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами и другими цитоплаз-матическими веществами, нарушая их функционирование, что влечет за собой гибель клетки [8, 15, 22].

В то же время отсутствуют данные о сравнительной оценке антибактериальных свойств хи-тозана в зависимости от степени полимеризации и уровня кислотности среды одновременно. Необходимость такого анализа связана с тем, что молекулы хитозана могут различаться по значению рКа в зависимости от молекулярной массы, и различие в степени протонирования аминогрупп хитозана может вносить свой вклад в проявление хитозаном биологической активности.

Поэтому целью данной работы являлось изучение антибактериальной активности ряда образцов хитозана, различающихся по молекулярной массе, при различных значениях кислотности среды в отношении K. pneumoniae.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для уточнения взаимосвязи между структурой хитозана и проявлением им биологической активности были использованы образцы хитозана, охарактеризованные как по молекулярно-массово-му распределению (ММР), так и по степени дезаце-тилирования (таблица). Используемые низкомолекулярные хитозаны были получены одним методом, а именно кислотным гидролизом, и обладали достаточно узким ММР (полидисперсностью), что позволило провести сравнительное исследование антибактериальных свойств серии из 12 образцов низкомолекулярного хитозана в диапазоне их молекулярных масс от 0.7 до 19.9 кДа. Для снижения влияния содержания ацетильных остатков использовали только образцы с высокой степенью дез-ацетилирования (за исключением образца № 7). Таким образом были созданы условия для проведения оценки антибактериальной активности хи-тозана в зависимости только от молекулярной массы в условиях контролируемого уровня кислотности среды.

Нами было определено, что взятые в эксперимент образцы имеют различные показатели р^а, которые зависели от степени полимеризации хитозана. Как видно из таблицы, олигомерные формы хитозана, то есть обладающие наименьшей молекулярной массой, обладали более высокими значениями рКа по сравнению с более высокомолекулярными образцами. Наибольшим значением рКа, равным 7.1, обладал образец с наименьшей средней степенью полимеризации, пример-

Характеристика образцов хитозана*

Номер образца М,, кДа ИП СП СД, моль % рка

1 0.7 1.41 4 95 7.1 ± 0.05

2 1.5 1.39 8 93 6.7 ± 0.05

3 2.0 1.40 12 97 6.6 ± 0.05

4 2.2 1.34 13 97 6.6 ± 0.05

5 3.5 1.71 20 95 6.5 ± 0.05

6 4.2 1.38 24 97 6.5 ± 0.05

7 5.5 2.28 32 78 6.5 ± 0.05

8 8.3 1.50 49 99 6.4 ± 0.05

9 9.6 1.44 56 97 6.4 ± 0.05

10 12.7 1.39 74 95 6.4 ± 0.05

11 15.0 1.61 87 94 6.4 ± 0.05

12 19.9 1.66 116 98 6.4 ± 0.05

13 600000* - 3400 85 6.4 ± 0.05

ИП — индекс полидисперсности; СП — средняя степень полимеризации (рассчитана из значения Мж); СД — степень дезаце-тилирования; ** Средневязкостная молекулярная масса (Ми).

но соответствующий смеси тетрамер—пентамер. Данный образец по этому показателю был наиболее близок по значению рКа к мономеру хитозана — глюкозамину, у которого рК составляет 7.9. С ростом степени полимеризации прогнозируемо уменьшалось и значение рКа хитозана, достигая у образца со степенью полимеризации 49 величины 6.40, которое далее у более высокомолекулярных образцов, в том числе и у исходного высокомолекулярного хитозана, не изменялось.

Принимая во внимание, что от величины рКа зависит не только степень протонирования аминогрупп хитозана, но и его растворимость, нами были проведены исследования по выпадению

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком