БИОЛОГИЯ МОРЯ, 2005, том 31, № 5, с. 380-383
УДК 582.52:615.322:612.396.11 ФАРМАКОЛОГИЯ
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ НИЗКОЭТЕРИФИЦИРОВАННОГО ПЕКТИНА ИЗ МОРСКОЙ ТРАВЫ ZOSTERA MARINA И ПРЕПАРАТОВ-АНТИОКСИДАНТОВ IN VITRO1
© 2005 г. Е. А. Коленченко1, Л. Н. Сонина2, Ю. С. Хотимченко1' 2
'Институт биологии моря ДВО РАН, Владивосток 690041;
2Владивостокский государственный медицинский университет, Владивосток 690990 e-mail: inmarbio@mail.primorye.ru
Статья принята к печати 4.05.2005 г.
С помощью двух методов in vitro, позволяющих оценить восстанавливающую активность веществ (метод FRAD) и их способность тормозить железо-аскорбатиндуцированное окисление твина 80 до малонового диальде-гида, проведены сравнительные исследования антиоксидантных свойств низкоэтерифицированного пектина, выделенного из морской травы Zostera marina, и лекарственных препаратов-антиоксидантов: милдроната и эмокси-пина. Установлено, что пектин обладает более высокой восстанавливающей активностью по сравнению с милдронатом и эмоксипином. Способность пектина ингибировать окисление твина 80 до малонового альдегида выше, чем у эмоксипина.
Ключевые слова: антиоксиданты, антиоксидантная активность, пектин, зостерин, Zostera marina, метод FRAD.
A comparative evaluation of antioxidant activity of low-esterified pectin from the seagrass Zostera marina and antioxidative drugs in vitro. E. A. Kolenchenko', L. N. Sonina2, Yu. S. Khotimchenko'' 2 ('institute of Marine Biology, Far East Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690041; 2Vladivostok State Medical University, Vladivostok 690990)
A comparative study of the antioxidant power of low-esterified pectin extracted from the seagrass Zostera marina and antioxidative medicinal drugs, mildronat and emoxypin, was performed. The reducing activity of the compounds (FRAD assay), as well as their ability to inhibit iron and ascorbate induced oxidation of tween 80 to malondialdehyde were assessed. The pectin zosterine exhibited a higher reducing activity, compared to medicines. Inhibitory capacity of zosterine was lower than that of mildronat. (Biologiya Morya, Vladivostok, 2005, vol. 31, no. 5, pp. 380-383).
Key words: antioxidants, antioxidant activity, pectin, zosterine, Zostera marina, FRAP assay.
Проблемы химической регуляции окислительного стресса и поиск биологически активных веществ, обладающих антиоксидантной активностью, находятся в центре внимания исследователей по различным направлениям экспериментальной биологии и биомедицины (Halvorsen et al., 2002; Matthaus, 2002; Ladas et al., 2004). В физиологических условиях окислительно-восстановительные процессы, обеспечивающие энергетические потребности клеток и утилизацию кислорода в тканях, контролируются регуляторными системами, поддерживающими сбалансированное взаимодействие реакции образования продуктов оксидации и антиокислительных факторов. Нарушение этого взаимодействия, сопровождаемого активацией свободно-радикальных процессов и накоплением продуктов перекисного окисления липидов, рассматривается в качестве универсального механизма повреждения биологических мембран (Halliwell, 2001; Vertuani et al., 2004), лежащего в основе ряда патологических процессов (Kaul et al., 2001; Gaetke, Chow, 2003).
Исследование связи окислительного стресса с развитием многих заболеваний показало, что эндогенная антиокси-дантная система не обеспечивает в достаточной степени защиту клеток и тканей от повреждающего действия свободных радикалов. Поэтому вполне оправдан поиск новых средств подавления прооксидантных процессов и активации реакций антиоксидации (Fang et al., 2002; Violi et al., 2004).
Среди природных соединений, обладающих высокой биологической активностью, обращает на себя внимание по-
лисахарид зостерин, получивший свое название по источнику его выделения - морской травы Zostera marina семейства Zosteraceae. Зостерин является пектином с крайне низкой степенью этерификации (Ovodov et al., 1975). Экспериментальные исследования с пектином-зостерином выявили у него такие фармакологические эффекты, как гипохолестеринемиче-ский, энтеросорбционный, антибактериальный, противовирусный, противоопухолевый, противоязвенный и иммуномо-дулирующий (Лоенко и др., 1997). Некоторые из перечисленных эффектов сопровождаются снижением уровня продуктов перекисного окисления липидов и нормализацией показателей эндогенной антиоксидантной системы в крови и печени экспериментальных животных (Иванова, Янькова, 1998; Ха-сина и др., 2003). Эти данные предполагают наличие у исследуемого полисахарида антиоксидантного эффекта.
Ингибирование Ре2+-аскорбатиндуцированного окисления твина 80 до малонового диальдегида зостерином, милдрона-том и эмоксипином in vitro
Исследуемое вещество Степень ингибирования, %
1% раствор 0.5% раствор 0.1% раствор
Милдронат 23.4±0.5 16.3±0.5 8.6±0.6
Зостерин 10.9±0.6 5.3±0.4 1.7±0.3
Эмоксипин 6.5±0.4 6.5±0.4 2.0±0.3
'Работа поддержана грантом Президиума ДВО РАН и Президиума СО РАМН № 05-П-СМ-05-006.
Рис. 1. Динамика восстановления трехвалентного железа низкоэтерифицированным пектином из морской травы Zostera marina in vitro. 1 - 1% раствор, 2 - 0.5% раствор, 3 - 0.1% раствор.
Цель настоящей работы - установление антиоксидант-ной активности низкоэтерифицированного пектина из морской травы Z. marina и сравнение этой активности с таковой лекарственных препаратов, применяемых в медицине в качестве антиоксидантных средств.
Материал и методика. Морскую траву Zostera marina собирали в чистых акваториях зал. Петра Великого Японского моря. Выделение пектина проводили по методике, включающей кислотный гидролиз сырья, экстракцию оксалатом аммония и осаждение пектина этанолом (Ovodova et al., 1968). Содержание галактуроновой кислоты в пектине определяли колориметрическим гидроксидифениловым методом (Blumen-krantz, Asboe-Haunsen, 1973). Степень этерификации устанавливали титриметрическим методом (Афанасьев и др., 1984). Характеристическую вязкость определяли в смеси 0.05 М раствора хлористого натрия и 0.005 М раствора оксалата натрия при температуре 25.0°С и рН 6.0, используя вискозиметр Уббелода (Kravtchenko, Pilnic, 1990). Физико-химические характеристики тестируемого образца полученного полисаха-
рида были следующими: содержание галактуроновой кислоты - 70.0%, степень этерификации - 7.9%, характеристическая вязкость - 620 мл/г галактуронана.
В работе исследованы следующие лекарственные пре-параты-антиоксиданты: милдронат - 10% раствор (ПАО "Гриндекс", Латвия) и эмоксипин - 1% раствор (ФГУП "Московский эндокринный завод", Москва).
Антиоксидантную активность тестируемых веществ изучали с помощью двух методов in vitro. В первом методе оценивали восстанавливающую активность исследуемых веществ (метод FRAP). К 0.3 мл инкубационной смеси, содержащей 0.5 мкМ раствор FeCl3, 0.25 мкМ раствор 2,4,6-трипи-ридил-Б-триазина в 1 мкМ HCl и 75 мкМ ацетатный буфер (рН 3.6), добавляли 0.04 мл 0.1, 0.5 или 1% раствора препаратов. Восстанавливающую активность определяли спектрофо-тометрически по количеству образовавшегося в течение 60 мин окрашенного комплекса Fe2+ с 2,4,6-трипиридил-Б-триазином при длине волны 593 нм и выражали в мкМ Fe2+ (Benzie, Strain, 1996; Ruperez et al., 2002).
10 20 30 40 50 60
Время, мин
Рис. 2. Динамика восстановления трехвалентного железа эмоксипином in vitro. 1 - 1% раствор, 2 - 0.5% раствор, 3 - 0.1% раствор.
382
КОЛЕНЧЕНКО И ДР.
Рис. 3. Динамика восстановления трехвалентного железа милдронатом in vitro. 1 - 1% раствор, 2 - 0.5% раствор, 3 - 0.1% раствор.
Во втором методе об антиоксидантной активности судили по ингибированию Fe +-аскорбатиндуцированного окисления твина 80 (сорбитанмоноолеата) до малонового диальде-гида. Для этого к 2.4 мл инкубационной среды, содержащей 0.8% твина 80, 0.08 мМ сернокислого железа и 0.8 мМ аскорбиновой кислоты, добавляли 0.2 мл 0.1, 0.5 или 1% раствора препаратов. Полученную смесь инкубировали в течение 48 ч при температуре 37°С, затем к 2.0 мл смеси приливали 1.0 мл 40% раствора трихлоруксусной кислоты и через 60 мин центрифугировали при 8000 об/мин 15 мин. После этого к 1 мл надосадочной жидкости добавляли 2 мл 0.25% раствора тио-барбитуровой кислоты и кипятили в водяной бане в течение 15 мин. Об антиоксидантной активности препаратов судили по степени ингибирования ими окисления твина 80 до малонового диальдегида и выражали в процентах (Галактионова и др., 1998).
Статистическую обработку результатов проводили с вычислением средней арифметической и ее стандартной ошибки по данным шести экспериментов, используя пакет статистических программ Statistica for Windows г. 5.1 b (StatSoft Inc.).
Результаты и обсуждение. В первой серии опытов сравнивали восстанавливающую активность низкоэтерифи-цированного пектина из морской травы Zostera marina, измеренную по восстановлению трехвалентного железа в условиях in vitro, с таковой антиоксидантных средств (рис. 1-3). Установлено, что максимальной восстановительной способностью обладал пектин. Количество образовавшегося восстановленного железа в реакции с 1% раствором пектина через 60 мин инкубации составляло 740.5 ± 18.8 мкМ Fe2+, с 0.5% раствором - 415.3 ± 10.1 мкМ Fe2+ и с 0.1% раствором - 101.2 ± ± 3.7 мкМ Fe2+ (рис. 1). Эмоксипин и милдронат обладали более низкой восстановительной способностью по сравнению с пектином. Причем восстанавливающая активность эмоксипи-на была выше, чем милдроната. Количество образовавшегося восстановленного железа в реакции с 1% раствором эмокси-пина через 60 мин инкубации составляло 49.1 ± 1.0 мкМ Fe2+, с 0.5% раствором - 38.1 ± 0.9 мкМ Fe2+, с 0.1% раствором -25.8 ± 0.6 мкМ Fe2+ (рис. 2). Количество образовавшегося восстановленного железа в реакции с 1% раствором милдро-ната через 60 мин инкубации составляло 26.2 ± 0.7 мкМ Fe2+, с 0.5% раствором - 21.9 ± 0.7 мкМ Fe2+ и с 0.1% раствором -
13.6 ± 0.5 мкМ Fe + (рис. 3). Увеличение концентрации пектина в 10 раз (от 0.1 до 1%) приводило к увеличению содержания восстановленного железа, полученного через 60 мин после начала инкубации, в среднем в 4
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.