МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2013, том 47, № 2, с. 267-274
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 57.083.18,57.088.1,616-002.5,616.24-008.8-076.5
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ "ТБ-БИОЧИП", "Xpert MTB/RIF" И "GenoType MTBDRplus"
ДЛЯ БЫСТРОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МУТАЦИЙ, ОТВЕТСТВЕННЫХ ЗА ЛЕКАРСТВЕННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ Mycobacterium tuberculosis complex (В РЕСПИРАТОРНОМ МАТЕРИАЛЕ ПАЦИЕНТОВ МОСКОВСКОГО РЕГИОНА)
© 2013 г. Е. Ю. Носова*, М. А. Краснова, К. Ю. Галкина, М. В. Макарова,
В. И. Литвинов, А. М. Мороз
Московский городской научно-практический центр борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы, Москва, 107014 Поступила в редакцию 31.05.2012 г. Принята к печати 27.08.2012 г.
Определены частоты встречаемости и сочетаний мутаций, которые ответственны за лекарственную устойчивость штаммов микобактерий туберкулеза (МБТ), выявленных в респираторном материале пациентов Московского региона. В монорезистентных к изониазиду штаммах МБТ преобладает мутация Ser315Thr в гене katG (15.8%). Среди МБТ с множественной лекарственной устойчивостью наиболее часто встречаются сочетания замен Ser531Leu в гене rpoB и Ser315Thr — в гене katG (26.3%), а также в трех генах — Ser531Leu в rpoB, Ser315Thr в katG и С(-15уГ в inhA (5.3%). Анализировали эффективность применения молекулярных тестов "ТБ-БИОЧИП" (ООО "БИОЧИП-ИМБ", Россия), "Xpert MTB/RIF" ("Cepheid", США) и "GenoType MTBDRplus" ("Hain Lifescience", Германия), сопоставляя эти данные с данными люминесцентной микроскопии и автоматизированной бактериологической системы BACTEC TM. С помощью указанных трех тест-систем ДНК МБТ обнаружена в мокроте в 92, 78 и 49% случаев соответственно. Эти результаты совпадают с результатами бактериологического определения лекарственной чувствительности МБТ к рифампицину (тест "Xpert MTB/RIF"), рифампицину и изониазиду (тест "ТБ-БИОЧИП" и "GenoType MTBDRplus") на 100, 97 и 100% соответственно. Таким образом, в лабораторной диагностике туберкулеза тест-система "Xpert MTB/RIF" наиболее эффективна для выявления ДНК МБТ, в то время как только тест-система "ТБ-БИОЧИП" достаточно чувствительна при обнаружении ДНК МБТ в мокроте и одновременно при определении множественной лекарственной устойчивости (к двум основным противотуберкулезным препаратам — рифампицину и изониазиду).
Ключевые слова: ДНК M. tuberculosis, рифампицин, изониазид, "Xpert® MTB/RIF", "ТБ-БИОЧИП", "GenoType MTBDRplus", респираторный материал, определение лекарственной чувствительности.
COMPARING PERFORMANCE OF "TB-BIOCHIP", "Xpert® MTB/RIF" AND "GenoType MTBDRplus" ASSAYS FOR FAST IDENTIFICATION OF MUTATIONS IN THE Mycobacterium tuberculosis COMPLEX IN SPUTUM FROM TB PATIENTS, by E. Yu. Nosova*, M. A. Krasnova, K. Yu. Galkina, M. V. Makaro-va, V. I. Litvinov, A. M. Moroz (Scientific and Clinical Antituberculosis Center, Moscow Government Health
Принятые сокращения: MSAC (Scientific and Clinical Antituberculosis Center of Moscow Government Health Department) — Московский городской научно-практический центр борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы (МНПЦБТ)^Х — тест-система "Xpert MTB/RIF"; "Xpert MTB/RIF" — тест-система для одновременного выявления M. tuberculosis и для определения лекарственной чувствительности к рифампицину; "GenoType MTBDRplus" — тест-система для одновременного выявления M. tuberculosis и для определения лекарственной чувствительности к рифампицину и изониазиду; BACTEC TM MGIT TM 960 — автоматизированная система; MTBDR — тест-система "GenoType MTBDRplus"; rpoB — ген, кодирующий фермент РНК-полимеразу (RpoB); katG — ген, кодирующий каталазу-пероксидазу; inhA — промо-торная и структурная области гена, кодирующего еноил-ацил-редуктазу; oxyR-ahpC — межгенная регуляторная область генов, кодирующих алкилгидропероксид-редуктазу и регулятора трансляции; "ТБ-БИОЧИП" — тест-система для одновременного выявления M. tuberculosis и для определения лекарственной чувствительности к рифампицину и изониазиду; МБТ — микобактерии туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis); МБТ-МЛУ — микобактерии туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью; КУМ — кислотоустойчивые микобактерии; НТМБ — нетуберкулезные микобактерии; ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография; wt (wild type) — штамм дикого типа, чувствительный к рифам-пицину и изониазиду.
* Эл. почта: rna68@rambler.ru
267
6*
Department, 107014 Russia; *e-mail: rna68@rambler.ru). The frequency of mutations causing drug resistance in MTB isolates were studied in the respiratory material obtained from TB-patients in the Moscow Region. In izoniazid-resistant isolates, the most prevalent mutation was found to be the Ser315Thr substitution in the katG gene (15.8%) whereas the most frequent mutations in multidrug-resistant isolates were Ser531Leu and Ser315Thr in the rpoB and katG genes (26.3%), or a combination of these two substitutions with a T15 mutation in the inhA gene (5.3%). We compared performance of three molecular assays — "TB-BIOCHIP" ("BIO-CHIP-IMB", Ltd, Russia), Xpert MTB/RIF ("Cepheid", USA) and GenoType MTBDRp/и« ("Hain Life-science", Germany), with the efficiency of luminescent microscopy, and phenotypic drug-suscepibility testing in an automated system BACTEC™ MGITtm 960 (Becton, Disckinson and Company, USA). Xpert MTB/RIF, TB-BIOCHIP and GenoType MTBDRp/и« detected MTB in sputum in 92, 78 and 49% of all culture-positive cases, respectively. The agreement between standard cultural data and molecular DST results for Xpert MTB/RIF (resistance towards rifampicin), for TB-BIOCHIP and GenoType MTBDRp/и« (resistance towards rifampicin and izoniazid) amounted to 100, 97 and 100% respectively. Summing up, Xpert MTB/RIF was concluded to be the most efficient assay for primary detection of MTB, whereas the TB-BIOCHIP was shown to be the only molecular assay sensitive enough for simultaneous detection of MTB DNA and for revealing multidrug resistance in sputum (i.e. resistance to both first-line anti-TB drugs, rifampicin and izoniazid).
Keywords: M. tuberculosis DNA, rifampicin, isoniazid, TB-BIOCHIP, Xpert MTB/RIF, GenoType MTBDRplws, respiratory material, drug susceptibility testing.
DOI: 10.7868/S0026898413010102
За последние два десятилетия молекулярные тест-системы, основанные на анализе последовательностей нуклеиновых кислот Mycobacterium tuberculosis complex (МБТ), вошли в мировую практику микобактериологических лабораторий противотуберкулезных учреждений [1]. Развитие лекарственной устойчивости МБТ, связанной, главным образом, с возникновением мутаций в генах-мишенях антибактериальных препаратов, распространение штаммов МБТ с множественной лекарственной устойчивостью (МБТ-МЛУ) (с одновременной устойчивостью к основным противотуберкулезным препаратам изониазиду и рифампицину) способствовали появлению новых молекулярных тестов для быстрого и специфического обнаружения этих опасных штаммов непосредственно в диагностическом материале больных [2-4].
На сегодняшний день для практического применения особенно важны три молекулярные технологии: "Xpert MTB/RIF" ("Cepheid", США) на платформе "GeneXpert", метод на основе олиго-нуклеотидных микрочипов (биочипов) — "ТБ-БИОЧИП" (ООО "БИОЧИП — ИМБ", Россия) и "MTBDRplus" ("Hain Lifescience", Германия).
"Xpert MTB/RIF" — это тест-система в формате картриджа для использования с системой GeneXpert®, которая включает, во-первых, выделение ДНК МБТ из диагностического материала пациента, во-вторых, мультиплексную ПЦР в режиме реального времени для одновременного выявления МБТ и определения генетических детерминант лекарственной устойчивости (мутаций) к одному противотуберкулезному препарату (ри-фампицину) в гене rpoB МБТ, а также и автомати-
ческую интерпретацию результатов реакции. Полный цикл исследования занимает 2.5 ч. Тест обладает высокой чувствительностью (106—176 КОЕ/мл) и специфичностью (100%) при исследовании респираторного материала, полученного от больных из разных стран мира с высоким и низким уровнем заболеваемости туберкулезом [5, 6].
Технология гибридизационного анализа на основе олигонуклеотидных биочипов, разрабатывавшаяся с конца 80-х гг. ХХ века в Российской Федерации под руководством А.Д. Мирзабекова, первой появилась на рынке в качестве молеку-лярно-генетического диагностикума для выявления лекарственно-устойчивого туберкулеза. Оли-гонуклеотидные микрочипы, представляют собой подложки с гидрогелевыми элементами и иммобилизованными в них олигонуклеотидными зондами. Созданная на основе данной технологии тест-система "ТБ-БИОЧИП" позволяет за 24 ч выявить ДНК МБТ в респираторном материале и определить 27 вариантов мутаций в гене rpoB, девять мутаций в гене кatG, пять — в гене inhA и пять — в межгенной области ahpC/oxyR, которые все ответственны за развитие множественной лекарственной устойчивости МБТ [7, 8].
Тест-система "ОепоТуре МТВВЯр1ш", основанная на гибридизации ПЦР-продуктов с ДНК-зондами на мембранах (стрипах), позволяет определять ДНК МБТ в мокроте и, кроме того, четыре наиболее часто встречающиеся мутации в гене rpoB (устойчивость к рифампицину) и генах katG и inhA (устойчивость к изониазиду). Время исследования — 48 ч. Тест предлагается применять для скрининга и быстрого выявления МБТ-МЛУ в мокроте с положительным результатом микро-
скопии (БК+) или в культурах, выделенных на жидкой и/или плотных питательных средах [9].
Все названные методы разрешены Министерством здравоохранения и социального развития РФ к применению в медицинской практике и достаточно широко используются в учреждениях противотуберкулезной службы РФ. Тем не менее, сравнительный анализ их свойств на одном и том же респираторном материале проводится впервые, что, с нашей точки зрения, позволяет выявить сильные и слабые стороны тестов.
Цель нашего исследования — определить частоты встречаемости и сочетаний мутаций, ответственных за лекарственную устойчивость штаммов микобактерий туберкулеза (МБТ), выявляемых в респираторном материале пациентов Московского региона, а также провести сравнительный анализ тест-систем "Xpert M
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.