МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 3, с. 336-345
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.22
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ИНДУКТИВНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ РАЗЛИЧНЫХ ПО АНТИГЕННЫМ СВОЙСТВАМ ЛЕКТИНОВ АЗОСПИРИЛЛ НА СИГНАЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ КОРНЕЙ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ
© 2014 г. С. A. Аленькина1, Л. П. Петрова, M. ^ Соколова, М. П. Чернышова, К. A. Трутнева, В. А. Богатырев, В. Е. Никитина
Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов Поступила в редакцию 03.07.2013 г.
Показано, что лектины ассоциативных азотфиксирующих бактерий Azospirillum Ьга8Иете $р7 и его мутанта Azospirillum Ьгаяйете $р7.2.3 способны в различной степени оказывать влияние на компоненты сигнальных систем корней проростков пшеницы — регулировать содержание цАМФ, оксида азота, диацилглицерина, салициловой кислоты, а также индуцировать активность супероксиддис-мутазы, липоксигеназы. Полученные результаты дают основание рассматривать лектины азоспи-рилл в качестве индукторов сигнальных систем корней проростков пшеницы, так как при их воздействии происходит возникновение нескольких потоков первичных сигналов. Полученные данные имеют и общебиологическое значение, так как лектины содержатся во всех живых организмах и большинство функций лектинов остаются не вполне выясненными.
Ключевые слова: ризосфера, ассоциативная азотфиксация, лектины азоспирилл, корни проростков пшеницы, сигнальные молекулы.
DOI: 10.7868/S0026365614030021
Ассоциативные бактерии рода Azospirillum занимают важное место среди микроорганизмов, обладающих потенциалом стимулировать рост и развитие растений. Растения получают непосредственную выгоду от способности микроорганизмов к азотфиксации, продукции фитогормонов, солюбилизации фосфатов, к улучшению водного и минерального статуса, продукции ряда соединений, увеличивающих мембранную активность, пролиферацию тканей корневой системы, а также уменьшающих влияние стрессоров на растение и осуществляющих контроль многочисленных фитопатогенов [1—3]. К механизмам опосредованного растением биоконтрольного эффекта относится способность индуцировать у растений защитные реакции, направленные на повышение устойчивости. Сигнальными молекулами, запускающими каскад защитных реакций, могут быть салициловая кислота, бактериальные липополи-сахариды, сидерофоры.
Многие азоспириллы не способны проникать в клетки растения, и это предполагает, что бактерии способны к образованию сигнальных молекул, которые проникают через растительную кле-
1 Автор для корреспонденции (е-шаП: alenkina@ibppm.sgu.ru).
точную стенку и узнаются мембранными рецепторами растения. Это взаимодействие инициирует цепь событий, приводящих к изменению метаболизма растения. Ответ растений на клеточном уровне может служить индикатором взаимодействия растений с бактериями, опосредованного бактериальными молекулярными сигналами. Известно, что связывание клеточных рецепторов A. brasilense Sp245 с агглютинином зародышей пшеницы — АЗП, вызывает изменения в метаболизме бактериальной клетки: повышает азотфик-сацию, выделение ионов аммония, синтез индо-лилуксусной кислоты (ИУК), изменяет соотношение кислых фосфолипидов мембраны. АЗП может функционировать как сигнальная молекула в ассоциации Azospirillum—растение [4].
В то же время известно, что некоторые штаммы Azospirillum способны к продукции различных лектинов in vitro [5]. Никитина с соавторами (1996) [6] показала присутствие на поверхности клеток азоспирилл лектинов, вовлеченных в бактериальную адгезию к корням. С поверхности бактерий A. brasilense Sp7 был изолирован лектин, являющийся гликопротеином с молекулярной массой 36 кДа и специфичностью к L-фукозе (1.87 мМ) и D-галактозе (20 мМ). Лектин мутант-
ного штамма А. ЬгазИете 8р7.2.3 имел идентичную лектину родительского штамма молекулярную массу и углеводную специфичность, но отличался антигенными свойствами [7]. Было показано, что эти белки проявляют различную функциональную активность. Лектины с различной эффективностью оказывали воздействие на активность а-, Р-глюкозидаз и Р-галактозидазы в мембране и фракции апопластов корней проростков пшеницы [2].
Целью данной работы явилось выявление сигнальных функций лектинов А. ЬгазИвтв 8р7 и 8р7.2.3 (в их сравнении) в ответных реакциях растений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Микроорганизмы и условия культивирования.
Объектами исследования служили два штамма азотфиксирующих ассоциативных бактерий рода Azospirillum — A. brasilense Sp7, полученный из Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН (г. Москва) и его мутант, дефектный по лек-тиновой активности — A. brasilense Sp7.2.3 [7].
Выделение лектинов с поверхности клеток проводили методом, описанным ранее [7].
Стерилизация семян, получение корней проростков и предобработка корней препаратами лектинов. Семена пшеницы Triticum aestivum L. сорта "Саратовская 29" (ГНУ НИИ Сельского хозяйства Юго-Востока РСХА, Саратов, Россия) были поверхностно стерилизованы в 70% (об./об.) этаноле 1 мин, отмыты стерильной водой. Для получения корней проростков семена были выращены в асептических условиях в чашках Петри на стерильной дистиллированной воде.
Определение концентрации белка проводили по методу Бредфорд [8].
Определение количества оксида азота (NO).
Количество NO определяли по нарастанию метаболитов — нитритов (NO-), в гомогенате корней с помощью реактива Грисса, состоящего из равных объемов 0.3% сульфаниловой кислоты и 0.5% а-нафтиламина. После 10 мин контакта определяли оптическую плотность при 540 нм [9].
Определение количества цитруллина проводили с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ). Гомогенат корней проростков подвергали ТСХ на силикагеле 60А ("Merck", Германия) в системе растворителей, содержащей н-бутанол, уксусную кислоту и воду (4 : 1 : 1 по объему). Хроматограм-мы окрашивали раствором нингидрина [10] и идентифицировали цитруллин с помощью чистого коммерческого препарата. Пятна вырезали, элюировали и проводили количественное определение цитруллина при 570 нм.
Определение количества диацилглицерина (ДАГ).
Для получения липидных экстрактов корней проростков пшеницы применяли метод Фолча [11] и Блайя—Дайера [12]. Идентификацию компонентов липидов осуществляли методом ТСХ с использованием силикагеля в системе гексан : диэтило-вый эфир : уксусная кислота (55 : 45 : 1 по объему), качественными реакциями и сравнением хромато-графической подвижности образцов со стандартами [13]. Количество ДАГ определяли газожидкостной хроматографией. Метилирование проводили согласно [14]. Хроматографирование осуществляли на газовом хроматографе 8Ыша12и GH-2010 (Япония) с использованием капиллярной колонки Е§ш1у-1 ("8ире1со", США) длиной 30 м и диаметром 0.32 мм; скорость потока гелия — 34 мл/мин. Температура испарителя 270°С, детектора 270°С. Идентификацию ДАГ проводили по времени удерживания, сравнивая пики в образцах со стандартом.
Определение активности липоксигеназы. Активность липоксигеназы (КФ 1.13.11.12) в гомо-генатах корней определяли спектрофотометриче-ским методом, используя в качестве субстрата ли-нолевую кислоту [15].
Определение количества салициловой кислоты (СК). Для определения количества свободной и связанной форм СК корни (1 г) были тщательно отмыты дистиллированной водой и фиксированы горячим 96%-ным этанолом. Корни гомогенизировали, затем СК экстрагировали из корней 80%-ным кипящим этанолом. Экстракт был разделен на две части для получения свободной и связанной форм СК [16]. Определение содержания СК проводили на газовом хроматографе 8Ыта1ги GH-2010 (Япония) с использованием колонки Е§ш1у-1 ("8ире1со") при температуре 200°С.
Определение активности фенилаланин-аммиак-лиазы (ФАЛ). ФАЛ (КФ 4.3.1.5) экстрагировали из корней 0.1 М боратным буфером с рН 8.8 при 4°С в течение 30 мин при соотношении масса : объем 1 : 17. Реакционная смесь состояла из 0.1 мл ферментного препарата и 0.4 мл боратного буфера рН 8.8, содержащего 12 мМ Ь-фенилаланина. Реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Активность фермента определяли спектро-фотометрическим методом по изменению оптической плотности при 290 нм. Активность ФАЛ выражали в единицах оптической плотности (ДЕ/г сырой массы) [17].
Определение активности cупероксиддисмута-зы (СОД). Для определения активности СОД (КФ 1.15.1.11) корни гомогенизировали в 0.15 М фосфатном буфере (рН 7.8). Гомогенат центрифугировали в течение 15 мин при 7000 g. Активность фермента определяли по ингибированию скорости восстановления нитросинего тетразолия
Активность ФАЛ в корнях проростков после инкубации с лектинами А. ЬгаяНете $р7 и $р7.2.3
Обработка Активность ФАЛ, %
Вода(контроль) 100 ± 3
Лектин A. brasilense Sp7
5 мкг/мл 115 ± 5
10 мкг/мл 105 ± 4
20 мкг/мл 110 ± 6
40 мкг/мл 120 ± 3
Лектин A. brasilense Sp7.2.3
5 мкг/мл 150 ± 4
10 мкг/мл 210 ± 3
20 мкг/мл 110 ± 9
40 мкг/мл 105 ± 3
(НСТ) в неэнзиматической системе феназинме-тасульфата и НАДН [18].
ТРИТЦ-мечение лектинов и определение локализации лектинов на клетках корней проростков пшеницы. Для мечения бактериальных лектинов использовали флуоресцентный краситель — тет-раметилродаминизотиоцианат (ТРИТЦ) [19]. В целях проверки специфичности препарата проводили предварительный дот-анализ с использованием теней кроличьих эритроцитов. Тени эритроцитов кролика готовили путем осмотического гемолиза в 0.015 М растворе хлорида натрия. Затем тени ресуспендировали в этом же растворе и трижды отмывали в физиологическом растворе с последующим центрифугированием и отделением супернатанта в течение 10 мин при 3000 об/мин.
Реакцию иммунодота проводили на нитро-целлюлозных мембранах (диаметр пор 1.5 мкм, "Synpor"). Один мкл взвеси мембран эритроцитов (в работе использовали серию двукратных разведений) наносили на мембрану, расчерченную на квадраты размером 5 х 5 мм, подсушивали и фиксировали в сушильном шкафу при 60°С в течение 15 мин. Для предотвращения неспецифической сорбции метки как на образце, так и на поверхности носителя, мембрану инкубировали в растворе следующего состава: фосфатный буфер, рН 7.2; 0.2% БСА; 0.02% Твин-20 в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем ин
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.