РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014, том 8(17), № 4, с. 1035-1039
КРАТКОЕ СООБЩЕНИЕ
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДАХ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ
© 2014 г. Е.Г. Костоломова, Ю.Г. Суховей, С.В. Гольцов, Д.Ю. Сухнев
НПО «Тюменькриобанк», Тюмень, Россия Поступила: 28.08.2014. Принята: 01.09.2014
Изучен пролиферативный потенциал и жизнеспособность гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) пуповинной крови (ПК) в зависимости от способа криоконсервирования. Криоконсервирование образцов проводилось в программном замораживателе Planer и парах жидкого азота. Установлено, что для криоконсервирования образцов ГСК ПК целесообразно использовать программный замораживатель, так как при данном способе клетки остаются жизнеспособными и функционально полноценными.
Ключевые слова: пуповинная кровь, гемопоэтические стволовые клетки, длина теломер, криоконсервирование, колониеобразующая способность, проточная цитометрия
В связи с увеличением количества трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) пуповинной крови (ПК) и расширением показаний к их клиническому применению проблема создания банков длительного хранения стволовых клеток является весьма актуальной [1, 2]. Успех трансплантаций алло-генных ГСК ПК во многом зависит от качества и безопасности заготовленного клеточного материала [3, 4, 5].
Криоконсервирование является неотъемлемой частью процедуры длительного хранения клеточных биоматериалов. В большинстве случаев клетки сохраняют свою морфологию после замораживания-размораживания, но может наблюдаться снижение их жизнеспособности и нарушение клеточных функций, приводящее к снижению пролиферативных свойств и нарушению биологической активности.
Вопросы сохранности ГСК ПК на этапе их криоконсервирования и хранения, а также оценка их пролиферативного потенциала и способности к дифференцировке in vitro и in vivo требуют постоянного изучения и совершенствования.
Адрес: 625030, Тюмень, ул. Баумана, 112, кв. 610, Косто-ломовой Елене Геннадьевне. E-mail: lenakost@mail.ru
В исследовании использовалось 40 образцов пуповинной крови, полученных во время физиологических срочных родов. Информированное согласие рожениц на сбор пуповинной крови и проведение эксперимента было получено.
Сбор образцов пуповинной крови проводился в родильных домах г. Тюмени. Для исследований отбирались образцы, объем которых превышал 80 мл. ПК собирали в систему для сбора крови (Green Cross, Корея), содержащую стандартное количество гемоконсер-ванта CPDA (цитратно-фосфатно-декстроз-но-адениновый раствор).
Выделение ГСК ПК проводили методом автоматического выделения клеток с помощью клеточного сепаратора «SepaxS1000» (Biosafe, Швейцария).
В качестве криопротектора к концентрату ядросодержащих клеток ПК добавляли высо-коочищенный диметилсульфоксид (ДМСО) в сочетании с полиглюкином. Конечная концентрация ДМСО в криоконсервируемой среде составляла 5%. Для криоконсервирова-ния концентрата клеток пуповинной крови использовались два способа замораживания: спонтанное замораживание в парах жидкого азота и криоконсервирование в программном замораживателе PLANER Krio 560-16
(ENGLAND) автоматическим контролем процесса охлаждения каждого образца клеток.
Количество и жизнеспособность ГСК ПК оценивали), методом проточной цитометрии на проточном цитофлуориметре Beckman Coulter FS-500 Cytomics (Beckman Coulter, США) с помощью набора Stem-Kit TM Reagents (Beckman Coulter, США).
С целью изучения пролиферативного потенциала ГСК ПК определяли длину их те-ломер и колониеобразующую способность (КОЕ).
КОЕ ГСК пуповинной крови определяли с помощью культивирования клеточной суспензии в метилцеллюлозе в течение 14 сут. при температуре 37 °С в СО2 инкубаторе с подсчетом количества колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 х 105: КОЕ-ГМ - грану-лоцитарных-макрофагальных, КОЕ-Г — гра-нулоцитарных, КОЕ-М - макрофагальных, КОЕ-Эр —эритроцитарных, КОЕ-mix — смешанных. Для определения абсолютного количества гемопоэтических предшественников в 1 мл пуповинной крови, полученные величины КОЕ умножали на число мононуклеарных клеток в 1 мл крови.
Для определения длины теломер использовался набор PNA Kit/FITC (DAKO, Дания). Гибридизация клеток с теломерным зондом проводилась в соответствии с рекомендациями фирмы DAKO. В образцах, гибридизиро-ванных с теломерным зондом, производилось определение длины теломер на проточном цитофлуориметре Beckman Coulter FS-500 Cytomics (Beckman Coulter, Швейцария). Для исследования использовался световой фильтр с длиной волны 488 нм. Интенсивность флуоресценции выставляли при флуоресцентном сигнале в FL-1. Гейтировали клетки в G0/1 фазе клеточного цикла, где клетка имеет только одну копию своего генома. Оценка количества жизнеспособности и пролиферативной активности проводилась до и после криокон-сервации.
Математическую обработку данных проводили при помощи программы Kaluzav. 1.2 (Beckman Coulter, США). Статистическую обработку данных проводили при помощи программного обеспечения Statistica 6.1 (StatSoft).
""I-1—I lllll|-Г—I—I lllll|-1-1—I I I I I l|-1-1—I lllll
10° 101 102 103 7-AAD
Рис. 1. Гистограмма жизнеспособности ядросодержа-щих клеток СБ45 + пуповинной крови негативных по реакции с 7-ЛББ (А), нативный образец (Б) клетки крио-консервированные в программном замораживателе, (В) клетки криоконсервированные в парах азота.
Средний срок криохранения образцов ГСК ПК составил от 6 до 12 мес., средний объем крио-консервированных образцов — 19,9 ±1,1 мл. Жизнеспособность (CD45 + 7AAD-) ядросо-держащих клеток ПК до (96,3±3,1%) и после криоконсервации в программном замораживателе и парах азота составила (89,0±3,4% и 77,4±3,4%) соответственно (рис. 1). Абсолютное количество CD34 + -клеток после автоматической криоконсервации ПК снижалось с 0,18±0,05 х 106/мл до 0,11 ±0,03 х 106/мл и до 0,08±0,04 х 106/мл в парах азота.
КОЕ ГСК является достоверным показателем их пролиферативного потенциала. При исследовании КОС ГСК до замораживания среднее количество колоний на 1 х 105 ГСК ПК составило 40,28±2,45, КОЕ ГСК ПК, крио-консервированных в программном замора-живателе в среднем составила 39,66±1,09 при криоконсервировании в парах жидкого азота — 21,86±2,71 соответственно. При оценке КОЕ клеток ПК было показано, что количество колоний после криоконсервации в автоматизированной системе снижается не значительно в сравнении с замораживанием в парах азота (табл. 1, рис. 2).
Исследования зарубежных ученых сопоставимо с полученными результатами. В Японии при оценке качества 54 криоконсервиро-ванных образцов ПК из 9 различных банков ПК. Было показано, что процент сохранения ядросодержащих клеток, CD34 +-клеток и КОЕ-ГМ составил 96,0±11,3%, 83,0±17,0% и 88,6±41,2%, соответственно [6].
Определение длины теломер ГСК ПК проводили с использованием новейшей методики сочетания флуоресцентной гибридизации in situ и проточной цитометрии. Для изучения влияния криоконсервирования на реплика-тивный потенциал ГСК, зависящий от длины их теломер, нами было исследовано 40 образцов пуповинной крови. Выявлено достоверное уменьшение длины теломер в клетках после криоконсервирования (рис. 3, табл. 2).
При криоконсервировании клеток в программном замораживателе изменение пролиферативного потенциала ГСК ПК менее выражено, чем при замораживании в парах жидкого азота. Как известно, охлаждение биологического объекта с любой скоростью всегда сопровождается образованием разнообразных кристаллов льда. В момент перехода растворенной в клетке воды в кристаллическую форму — достижении точки эвтектики — происходит выделение допол-
Рис. 2. ГСК ПК. КОЕ А — до и после криоконсервации, Б — в программном замораживателе, В — парах азота.
нительного тепла за счет образования кристаллической решетки при переходе воды из жидкого состояния в твердое. Основные повреждения клетки наступают в точке перекристаллизации, так как в этот период
Таблица 1. Влияние различных способов криоконсервирования на КОЕ ГСК ПК
КОЕ Количество клеток, *105
До криоконсервации После криоконсервации
в программном замораживателе в парах жидкого азота
КОЕ-Эр 24,7±4,1 21,8±5,5 12,5±5,7* +
КОЭ-Г 18,5±3,0 17,0±2,7 7,5±1,6* +
КОЭ-ГМ 19,9±2,2 16,8±3,5 9,3±2,9* +
КОЭ-М 11,0±2,7 9,9±3,1 4,5±1,5* +
КОЕ-ш1х 26,1 ±5,0 24,7±3,9 13,5±4,6* +
Примечание: *р < 0,01по сравнению с образцом до криоконсервации; + р < 0,01по сравнению с образцом после криоконсервации в программном замораживателе.
КОЕ-ГМ — гранулоцитарно-макрофагальные, КОЕ-Г — гранулоцитарные, КОЕ-М — макрофагальные, КОЕ-Эр — эритроцитарные, КОЕ-ш1х — смешанные колониеобразующие единицы.
Таблица 2. Длина теломер ГСК ПК
Средняя длина теломер, кЬ
нативных клеток Криоконсервированных в программном замораживателе криоконсервированных в парах жидкого азота
15,7±2,9 13,5±1,9 7,8±1, 1
Рис. 3. Гистограммы идентификации клеток культуры, находящихся в G0/1-фазе клеточного цикла. Прямое светорассеяние, гейтирование области, в которой находятся клетки в фазе G 0/1 клеточного цикла. А— клетки перед криоконсервированием; Б — клетки после криоконсервирования
образуются концентрированные растворы солей, которые повреждают клеточные структуры. Этот период не должен длиться более 1,5 мин [7, 8, 9]. В проведенных нами исследованиях при замораживании в программном замораживателе время от наступления точки эвтектики и кристаллизации сокращено до 1,5 мин, а при замораживании в парах жидкого азота это время длилось более 5 мин.
Укорочение длины теломер при замораживании клеток ПК может быть связано с процессами повреждения ядерной мембраны [4, 10], так, как именно она повреждается при криоконсервировании в первую очередь [7]. Процессы криоконсервирования клеток могут приводить к транзиторным или органическим поражениям этих структур, и таким образом вызывать апоптоз клеток, что, безусловно, сказывается на их восстановлении
после размораживания [8]. Уменьшение длины теломер возможно, приводит к изменению экспрессии генов, что также может сказаться на функции клетки [4, 10].
Таким образом, при оценке жизнеспособ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.