ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 6, с. 599-603
УДК 581.1: 632.4:632.938
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ТРАНСКРИПЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ ГЕНОВ ЗАЩИТНЫХ БЕЛКОВ У РАЗНЫХ СОРТОВ ПШЕНИЦЫ В СВЯЗИ С УСТОЙЧИВОСТЬЮ К Septoria nodorum Berk
© 2014 г. Л. Г. Яруллина*, **, Р. И. Касимова*, А. Р. Ахатова*
*Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, Уфа 450054 **Башкирский государственный университет, Уфа 450074 e-mail: yarullina@bk.ru Поступила в редакцию 3.02.2014 г.
Проведено сравнение транскрипционной активности генов защитных белков (пероксидазы TC 151917, оксалатоксидазы AJ556991.1, ингибитора протеиназы EU 293132.1) в растениях пшеницы 5 районированных сортов (Омская 35 и 36, Симбирка, Башкирская 26 и Казахстанская 10) при инфицировании возбудителем септориоза Septoria nodorum Berk. Интенсивность развития возбудителя септориоза на листьях оценивали по площади инфекционного пятна в растительных тканях. Величина этого показателя оказалась минимальной у пшеницы сортов Омская 35 и 36 и максимальной — у сортов Симбирка и Казахстанская 10, сорт Башкирская 26 занимал промежуточное положение. По степени транскрипционной активности генов анионной пероксидазы, оксалатоксидазы и ингибитора протеиназы при инфицировании устойчивые к септориозу сорта превосходили чувствительные. Полученные данные свидетельствовали о перспективности использования уровня экспрессии генов AJ556991.1, TC 151917, EU 293132.1 в качестве маркеров для отбора устойчивых форм растений пшеницы.
DOI: 10.7868/S0555109914060178
В естественных условиях растения испытывают на себе действие разнообразных неблагоприятных факторов биотической и абиотической природы, и их выживание зависит от способности защитить себя от всех этих воздействий. Повышение устойчивости растений позволяет сохранить их продуктивность при воздействии патогенов. Один из подходов к пониманию механизмов, обеспечивающих устойчивость растений к различным типам возбудителей болезней, может включать сравнение физиологических показателей разных сортов пшеницы. В качестве показателей, характеризующих защитную реакцию растений при заражении, оценивали транскрипционную активность генов анионной пероксидазы (КФ 1.11.1.7), оксалатоксидазы (КФ 1.2.3.4) и ингибитора протеиназы. Эти белки относят к PR-белкам (ра1Ио§епе818-ге1а1её proteins), связанным с патогенезом [1—3]. Ключевая роль в защитной системе клеток растений при инфицировании отводится пероксидазам [4]. При действии на растение различных стрессовых факторов, перок-сидазы, благодаря своим свойствам, избавляют клетки от разрушительного влияния пероксида водорода (Н2О2), в том числе за счет утилизации активных форм кислорода (АФК) в процессах лиг-нификации [5]. Основной функцией оксалаток-сидазы является участие в деградации щавелевой кислоты, которая относится к факторам патоген-
ности большого числа возбудителей болезней сельскохозяйственных культур, в том числе Septoria nodorum Berk. [6]. Образующийся при этом Н2О2, как сигнальная молекула, может индуцировать развитие защитного ответа в растительных клетках [6]. Высокая активность оксалатоксидазы в молодых растениях, впоследствии снижается и практически не обнаруживается в старых органах [7]. Однако фермент может экспрессироваться при инфицировании, что предполагает ее участие в формировании и развитии защитного ответа растений [8]. Показано, что ингибиторы протеи-наз также участвуют в защитных реакциях растений [9]. Таким образом, изучение таких физиологических показателей, как транскрипционная активность генов защитных белков: пероксидазы TC 151917, оксалатоксидазы AJ556991.1 и ингибитора протеиназы EU293132.1 позволит не только выяснить их роль в формировании устойчивости растений, но и оценить возможность их использования в процессе отбора устойчивых форм растений.
Цель работы — определение интенсивности развития возбудителя септориоза S. nodorum на листьях растений пшеницы 5 сортов (Омская 35 и 36, Симбирка, Башкирская 26 и Казахстанская 10) и изучить в них транскрипционную активность генов пероксидазы TC 151917, оксалатоксидазы AJ556991.1 и ингибитора протеиназы EU293132.1.
МЕТОДИКА
Объект исследования. В качестве объектов исследования были выбраны растения пшеницы (Triticum aestivum L.) пяти районированных сортов, которые по предварительным данным различаются полевой устойчивостью к возбудителю септориоза S. nodorum: Омская 35, Омская 36, Сим-бирка, Башкирская 26 и Казахстанская 10. Семена проращивали на фильтровальной бумаге при комнатной температуре. Полностью развернутые листья 7-суточных проростков срезали и помещали во влажную камеру на фильтровальную бумагу. Срезы накрывали ватой, смоченной в растворе бензимидазола (40 мг/л) [10]. Отрезки листьев инфицировали суспензией пикноспор возбудителя септориоза S. nodorum. (106 спор/мл), которые были выделены из местной популяции гриба. Иноку-лированные листья выдерживали в течение 24 ч при комнатной температуре в темноте, после чего переносили на освещенную площадку с фотопериодом 16 ч и освещенностью 12—16 тыс. люкс (лампы ЛД-4, ЛБ-40). Интенсивность симптомов болезни оценивали через 6 сут после инфицирования. В качестве контроля использовали неинфицированные листья растений.
Активность оксалатоксидазы. Цитоплазматиче-скую (растворимую) фракцию фермента выделяли с использованием 0.05 М сукцинатного буфера, pH 3.8, (СБ). Для этого отрезки листьев гомогенизировали в СБ при соотношении 1 : 3 (вес/объем), затем центрифугировали в течение 20 мин при 12000 g ("Eppendorf", Германия). Супернатант (50 мкл) вносили в реакционную смесь для определения активности оксалатоксидазы, содержащую 100 мкл СБ, 10 мкл 0.0025 М щавелевой кислоты ("Реахим", Россия), 15 ед./мл пероксидазы хрена ("ДиаэМ", Россия) и 50 мкл 0.08%-ного хромоген-ного субстрата о-фенилендиамин (ОФД, "Реа-хим", Россия).
Активность пероксидазы. Для выделения ци-топлазматической (растворимой) фракции фермента отрезки листьев гомогенизировали в 0.01 М ^-фосфатном буфере, рН 6.2, (ФБ) в соотношении 1 : 3 (вес/объем). Гомогенат центрифугировали в течение 25 мин при 12000 g на центрифуге 5415К ("Eppendorf", Германия). В супер-натанте оценивали активность пероксидазы по окислению ОФД (0.15%-ного в 0.01 М ФБ) в присутствии 0.0015% Н2О2 микрометодом в планшетах для иммуноферментного анализа.
Оптическую плотность раствора окисленного ОФД определяли при 490 нм на приборе для им-муноферментного анализа Benchmark Microplate Reader ("BioRad", США). За единицу активности фермента принимали то количество ОФД, которое за 1 мин увеличивало оптическую плотность (AD) на 1 ед. Активность выражали в отн. ед. на 1 г сырой массы листьев.
Оценка экспрессионной активности генов оксалатоксидазы AJ556991.1, анионной пероксидазы TC 151917 и ингибитора протеиназ EU 293132.1.
Тотальную РНК из растений выделяли с помощью тризола (Molecular Research Center, Inc, США). Для получения кДНК проводили реакцию обратной транскрипции с использованием обратной транскриптазы M-MuLV ("Fermentas", США) согласно протоколу фирмы. Полимераз-но-цепную реакцию (ПЦР) проводили в ампли-фикаторе типа ТП4-ПЦР-01-"Терцик" (Россия). После амплификации фрагменты ДНК фракционировали методом электрофореза в 1—2%-ном агарозном геле или 7%-ном ПААГ в электрофоре-тической камере S2 ("Хеликон", Россия). В качестве положительного контроля использовали ПЦР гена, кодирующего конститутивно экспрес-сирующийся тубулин. С помощью программы "Primer Select" ("DNASTAR, Inc", США) были подобраны высокоспецифичные праймеры к гену оксалатоксидазы (AJ336991.1), анионной пероксидазы (TC151917) и ингибитора протеиназ (EU293132.1), фланкирующие фрагменты ДНК размером 410, 157 и 106 п.н. соответственно. Условия проведения ПЦР были подобраны экспериментальным путем. Компьютерный анализ аминокислотных и нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ Lasergene ("DNASTAR, Inc", США).
Статистическая обработка данных. Эксперименты включали не менее 3 биологических по-вторностей при анализе биохимических показателей и не менее 15 при анализе экспрессии. На рисунках приведены средние результаты опыта и их стандартные ошибки. Коэффициент корреляции рассчитывали по критерию Пирсона. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием компьютерных программ StatSoft (Statistica 6.0).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Изученные сорта пшеницы были распределены по интенсивности развития септориоза, которую оценивали по площади инфекционного пятна через 120 ч после инокуляции S. nodorum. Интенсивность развития септориоза была максимальной на листьях пшеницы Казахстанская 10, площадь инфекционного пятна 19.6 ± 1.3 мм2, в то время как на листьях пшеницы Омская 35 этот показатель был минимальным 7.3 ± 0.3 мм2. Сорта пшеницы Омская 36, Симбирка и Башкирская 26 по степени инфицируемости листьев патогенным грибом S. nodorum занимали промежуточное положение, площадь инфекционного пятна на их листьях составила 9.1 ± 0.4, 12.6 ± 0,9 и 15.9 ± ±1.1 мм2 соответственно. Таким образом, наибольшей устойчивостью к инфицированию возбудителем септориоза обладали растения пшеницы
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ТРАНСКРИПЦИОННОМ АКТИВНОСТИ ГЕНОВ
601
% к контролю 350
300 250 200 150 100
1
(а)
% к контролю 220
(б)
Hh ,
2
3
5
200 180 160 140 120 J 100
rïl
□ 24 ч
□ 48 ч
П*.
1
2
3
4
5
Рис. 1. Активность фермента (а) и экспрессия гена анионной пероксидазы TC151917 (б) в листьях растений пшеницы разных сортов через 24 и 48 ч после инфицирования S. nodorum (% от контроля). 1 — Омская 35, 2 — Омская 36, 3 — Симбирка, 4 — Башкирская 26, 5 — Казахстанская 10.
% к контролю 400
350 300 250 200 150 100
(а)
1 ■ П ,
% к контролю 240
(б)
220 200 180 160 140 120 -1 100
□ 24 ч
□ 48 ч
Рис. 2. Активность фермента (а) и экспрессия гена оксалатоксидазы Л1556991.1 (б) в листьях пшеницы разных сортов при инфицировании 8. nodorum (% от контроля). Обозначения как на рис. 1.
сорта Омская 35, а самой меньшей — сорта Казахстанская 10.
Заражение септориозом индуцировало повышение уровня экспрессии гена и активности перокси
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.