МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 1, с. 57-61
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.835.91.044
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ПОЛЛЮТАНТОВ НА СВОБОДНОЖИВУЩИЕ И ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ
БДЕЛЛОВИБРИОНЫ
© 2004 г. Н. Ю. Маркелова
Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино Поступила в редакцию 08.07.02 г.
Проведена сравнительная оценка динамики роста жизнеспособных свободноживущих и иммобилизованных на твердой поверхности хищных бактерий рода Вйе11оу1Ьг1о в присутствии мочевины и фенола - поллютантов, реально попадающих в окружающую среду в количествах, превышающих физиологически безопасный уровень. Показано, что клеточная оболочка бделлопласта выполняет защитную функцию в механизме адаптации бделловибрионов к повреждающему воздействию ксенобиотиков. Продемонстрирована защитная функция роста на поверхностях для выживания бделловибрионов в экологически неблагоприятных условиях.
Ключевые слова: экология Вйе11оу1Ьг1о, ассоциация Вйе11оу1Ьг1о с поверхностями, жизнеспособность бделловибрионов.
Известно, что процесс естественного самоочищения окружающей среды определяется рядом физических и химических факторов, а также функциональной активностью природных микробных популяций. Бактерии-хищники рода ВёеПоуШпо рассматриваются как биологический фактор, ответственный за поддержание микробного равновесия в природе [1]. Чрезвычайно высокая чувствительность жидких культур бактерий этого рода к различным физико-химическим воздействиям [2-4] предполагает возможность вторичных эффектов от загрязнения окружающей среды ксенобиотиками, а именно, нарушение процессов естественного самоочищения вследствие снижения функциональной активности бделловибрионов и дисбаланса микробных популяций. В то же время недавно нами были обнаружены хищные бактерии в сточных водах станции аэрации г. Санкт-Петербурга, где концентрации детергентов, тяжелых металлов и других токсикантов намного превышали экологически безопасный уровень [5]. В связи с этим остается неясным механизм функционирования и сохранения жизнедеятельности ВйеНо-угЬпо в природных экосиситемах. До недавнего времени хищные бактерии рассматривались как обитатели бактериопланктона водных экосистем. Однако оказалось затруднительно не только оценить экологическую роль хищников, но и объяснить сам факт их существования в водоемах, где концентрация потенциальных жертв намного ниже уровня, необходимого для развития бделловибрионов. В последние годы получила развитие концепция функционирования двухкомпо-нентной бактериальной системы хищник-жертва в
иммобилизованном состоянии как наиболее адекватной модели существования Bdellovibrio в естественной среде обитания [6]. Этой точке зрения соответствуют полученные нами недавно данные о лучшем выживании Bdellovibrio в присутствии поллютантов при культивировании бактерий-хищников в агаровом слое, чем в жидкой культуре [7]. По-видимому, бделловибрионы при росте в агаре не только сохраняют инфекционную активность, но и проявляют повышенную устойчивость к стрессорным воздействиям (поллютанты). Возможно, именно поверхности, как структуры для поддержания самовосстанавливающихся источников поступления бделловибрионов в водную толщу, играют роль регуляторов численности бактерий в условиях, благоприятствующих их размножению.
Цель настоящей работы - провести сравнительную оценку динамики выживаемости свободноживущих и иммобилизованных на твердой поверхности хищных бактерий рода Bdellovibrio в присутствии поллютантов - мочевины и фенола.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работу проводили с культурой Bdellovibrio bac-teriovorus 100 NCJB 9529, выделенной из почвы [8]. В качестве бактерии-хозяина использовали Pseudomonas fluorescens ВКМ-1471. Культивирование B. bacteriovorus и P. fluorescens и их взаимодействие проводили, как было описано ранее [7].
В качестве поллютантов использовали коммерческие препараты мочевины "BDH" (Англия) и фенола "Fisher Scientific, Co." (США). Фенол и
lg кл/мл
сут
Рис. 1 Влияние поллютантов на жизнеспособность жидкой бинарной системы P. fluorescens (1)-B. bacterio-vorus ( евободноживущие клетки + бделлопласты) (2). а - контроль (в отсутствие поллютантов), б - мочевина 0.5%, в - фенол 0.01%.
мочевину растворяли в дистиллированной воде и стерилизовали фильтрацией через фильтры "Nal-gene, Co." (США) с диаметром пор 0.1 мкм. Изучение взаимодействия бделловибрионов с псевдомонадами в жидкой культуре в присутствии 0.5% мочевины и 0.01% фенола проводили при 25°С в течение 15 суток, определяя через определенные интервалы времени количество клеток Bdellovibrio и их жертв, P. fluorescens, в 1 мл суспензии. Число клеток B. bacteriovorus и бделлопластов определяли по количеству бляшкообразующих единиц методом двухслойного агара согласно Stolp a. Starr [8], а количество клеток P. fluorescens - по числу колоний, выросших на триптон-соевом агаре (ТСА), "BBL MS, Becton Dickinson a.Co" (США), выражая в количестве колониеобразующих единиц (КОЕ).
Для изучения влияния поллютантов на поверхностно-растущие клетки двухкомпонентной системы осуществляли иммобилизацию B. bacteriovorus и P. fluorescens на прозрачном пластиковом носителе диаметром 12 мм "Fisher Scientific"
(США), как было описано ранее [6]. Поверхностно-ассоциированные двухкомпонентные культуры помещали в емкости с 3 мл дистиллированной воды, содержащие мочевину (0.5%) и фенол (0.01 и 0.5%) и выдерживали в течение 15 суток при комнатной температуре. Подсчет количества свободных и внутриклеточных (бделлопластов) клеток бделловибрионов, и интактных клеток псевдомонад на поверхности пластикового носителя проводили ежедневно после их окрашивания акридиновым оранжевым, как было описано ранее [6].
Эксперименты по оценке влияния поллютантов на выживаемость бделловибрионов проводили в четырех повторностях, в статье приведены их средние значения.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние мочевины и фенола на выживаемость хищных бактерий оценивали сравнением жизнеспособности как свободноживущих, так и иммобилизованных бделловибрионов в присутствии исследуемых поллютантов.
Для исследования процесса взаимодействия свободноживущих бделловибрионов с Р. Аыогвзсвт изучали динамику изменения количества клеток в бинарной жидкой культуре в течение 15 суток в присутствии поллютантов по сравнению с контролем (в отсутствие поллютантов). Рис. 1 демонстрирует взаимодействие бактерий в жидкой бинарной культуре, что выражается колебательным характером кривых роста обеих бактерий, более выраженным в контроле и менее - в опыте, где сказывается влияние поллютантов. В контроле (рис. 1а) в течение 7-10 суток взаимодействия поддерживалась численность хищников при одновременном снижении концентрации жертв, а далее количество бделловибрионов снижалось быстрее. В опыте (рис. 16, 1в) влияние поллютантов выражалось в равномерном уменьшении численности клеток в обеих культур бактерий, начиная с 3-их сут их взаимодействия в двухкомпонентной системе в присутствии как мочевины, так и фенола, причем, влияние фенола сказывалось больше, чем мочевины. Из представленных данных очевидно, что воздействие ксенобиотиков значительно снижало физиологическую активность бделловибрионов и практически взаимодействие бактерий в бинарной культуре снижалось с шестого дня культивирования, что согласуется с имеющимися литературными данными [2-4, 7].
Оценку взаимодействия бактерий-хищников с бактериями-жертвами на поверхности твердого носителя проводили, изучая динамику изменений их численности в бинарной бактриальной системе В. Ъа^епуогш и Р. fluorescens в течение 15 суток после прикрепления клеток к поверхности. Ранее динамика взаимодействия бактерий в той же
двухкомпонентной системе, иммобилизованной на прозрачном пластиковом носителе, была изучена в течение 24 часов [6]. В настоящей работе мы исследовали взаимоотношения между популяциями хищника и жертвы, развивающимися на поверхности в течение более длительного периода, а применение прозрачных пластиковых носителей и эпифлуоресцентной микроскопии позволило визуально наблюдать динамику межклеточного взаимодействия на поверхности носителя и проводить подсчет и дифференциацию клеток в течение всего эксперимента.
Как следует из рис. 2а (контроль), ход кривых, отражающих изменение численности свободных бдел-ловибрионов, бделлопластов и интактных клеток псевдомонад отражает их непрерывное взаимодействие в течение всего периода наблюдений. Данные опыта, представленные на рис. 2б-2г иллюстрируют развитие взаимоотношений между В. bacterivorus и Р. Аио^сет на пластиковой поверхности в присутствии исследуемых поллютантов. Как видно из представленных результатов, ответ поверхностно-ассоциированных двухкомпонентных культур на поступление поллютантов отличался от такового в жидкой культуре (рис. 1). В присутствии тех же концентраций мочевины и фенола, как и в жидкой культуре, взаимодействия бактерий в двухкомпонентной системе на поверхности носителя (рис. 26, 2в) продолжались в течение всего периода наблюдения (15 суток). Колебания числа клеток бделловибрио-нов, их жертв, клеток Р. Аио^сет, и внутриклеточных бделловибрионов (бделлопластов) указывают на постоянное возобновление циклов взаимодействия хищника и жертвы на поверхности носителя. Обращает на себя внимание тот факт, что в присутствии поллютантов число клеток бделлопластов превышает таковое свободных бделловибрионов, что возможно, объясняется способностью хищных бактерий блокировать терминальные стадии их инфекционного цикла и существовать длительное время внутри клетки-хозяина при неблагоприятных для их размножения условиях. Сделанный вывод подтверждает ранее опубликованное предположение [9, 7] о переживании бделловирионом неблагоприятных для его развития условий внутри инфицированной и уже мертвой клетки бактерии-жертвы, т.е. находясь в стадии бделлопласта. Следует отметить, что даже в присутствии такой критической концентрации ксенобиотика, как 0.5% фенола, наблюдалось выживание бделловибрионов в форме бделлопластов, хотя в этом случае нельзя говорить о продолжении процесса взаимодействия хищника и жертвы (рис. 2г). В данном варианте, после трех сут
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.