ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 11, с. 1491-1500
^ ГЕНЕТИКА ^^^^^^^^^^^^^^^^
РАСТЕНИЙ
УДК 575.17:633.11
СРАВНИТЕЛЬНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГОЛОЗЕРНОЙ ДИПЛОИДНОЙ ПШЕНИЦЫ Triticum sinskajae И ЕЕ ИСХОДНОЙ ФОРМЫ T. monococcum
© 2007 г. Н. П. Гончаров, Е. Я. Кондратенко, С. В. Банникова, А. А. Коновалов, К. А. Головнина
Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск 630090;
факс: (383) 333-12-78; e-mail: gonch@bionet.nsc.ru Поступила в редакцию 17.01.2007 г. Окончательный вариант получен 26.04.2007 г.
Изучено наследование ряда морфологических и биохимических признаков у диплоидного (2n = 2x = 14) голозерного вида Triticum sinskajae. Показано, что электрофоретический спектр запасных белков (глиадинов) T. sinskajae отличается только двумя компонентами от характерного спектра образца к-20970 T. monococcum, в популяции которого пшеница Синской была обнаружена. При изучении биохимического полиморфизма обнаружены различия между к-20970 T. monococcum и T. sinskajae только по медленной зоне 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, по остальным 8 изученным ферментным системам отличий не выявлено. При анализе нуклеотидных последовательностей ядерного Acc-1 (acetyl-CoA carboxylase) гена была обнаружена делеция длиной 46 пн в 11-м интроне у образца к-20970 T. monococcum, отсутствующая у T. sinskajae. Однако наличие внутривидового полиморфизма у T. monococcum по данному локусу не позволяет считать это отличие видоспецифичным. У T. sinskajae определен моногенный контроль ярового типа развития и подтверждены данные о моногенном контроле формы колоса типа "sinskajae". Последний признак контролируется рецессивным геном, в то время как форма колоса "monococcum" - доминантным. Показано, что признаки форма колоса "sinskajae", голозерность, мягкая чешуя, наличие остевидных придатков на колосковой чешуе и скошенное плечо колосковой чешуи наследуются слитно. Комплекс признаков, определяющий видовую принадлежность T. sinskajae, обусловливается либо одним (возможно, регуляторным) геном, либо рядом очень тесно сцепленных генов. Два других специфичных для T. sinskajae генов -awns, контролирующий безостость, и fig, обусловливающий нерасщепленную внутреннюю (цветковую) чешую, расположены на расстоянии 1.35 ± 0.98% и 3.34 ± 1.54% кроссинговера от гена mon, детерминирующего форму колоса "sinskajae".
Для филогенетических исследований в роде Triticum L. особый интерес представляет относящийся к секции Monococcon Dum. диплоидный (2n = 2х = 14) вид Triticum sinskajae A. Filat. et Kurk., так как он является единственным описанным к настоящему времени голозерным видом среди диплоидных пшениц [1]. Пшеница Синской была обнаружена при разборе материалов экспедиции П.М. Жуковского из причерноморских районов Турции в образце к-20970 культурной однозернянки T. monococcum L. [2]. Авторы, описавшие T. sinskajae в качестве самостоятельного вида, предполагают, что она - естественный голозерный мутант пленчатого диплоидного вида T. monococcum [2]. Признак "пленчатость - голозерность" является очень важным хозяйственным и таксономическим признаком у тетра- (2n = 4х = 28) и гексаплоидных (2n = 6х = 42) пшениц [1]. В то же время голозерные диплоидные пшеницы не были известны первобытному земледельцу [3]. В коллекциях генбанков вид T. sinskajae представлен единственным образцом к-48993. Полученная
A.A. Альдеровым и У.К. Куркиевым [4] коротко-стебельная линия T. sinskajae dwarf ни в один ген-банк не была передана. От культурной однозернянки T. monococcum пшеница Синской отличается прежде всего формой колоса (рис. 1), удлиненно-овальными однозерными колосками, менее ломким колосовым стержнем, более светлоокрашенным колосом, наличием остевидных придатков на колосковой чешуе и скошенным плечом. Кроме этого, у пшеницы Синской чешуи длиннее и шире, чем у T. monococcum. Оба вида легко скрещиваются между собой в эксперименте, давая плодовитое потомство [5], что позволяет исследователям изучать генетический контроль признаков у T. sinskajae.
Изучению наследования признаков у T. sinskajae посвящен ряд работ [5-7]. Показано, что голозерность у этого вида контролируется моногенно [5], равно как и наличие остевидных придатков на колосковой чешуе [6]. При изучении групп сцепления однозернянок у T. sinskajae были картированы гены, контролирующие запасные белки,
1491
4*
f h
Рис. 1. Колосья T. sinskajae (a) и T. monococcum (•).
мягкие расщепляющиеся чешуи и ряд количественных признаков, в том числе обусловливающих хлебопекарные качества [7]. J. Кшрпа et а1. [6] при определении групп сцепления у Т. топо-соссит также картировали на хромосоме 5А ряд видоспецифичных генов Т. sinskajae.
Цель данной работы - выявить морфологические и биохимические отличия между Т. sinskajae и Т. топососсит, изучить генетический контроль комплекса признаков, характерных для голозерного диплоидного вида Т. sinskajae, и использовать молекулярно-биологические методы для определения уникальности пшеницы Синской.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для изучения морфологических признаков образец к-48993 Т. sinskajae из коллекции ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова (СПб) скрещивали с рядом образцов Т. тотсоссит, обладающих контрастными по отношению к первому виду признаками. Используемые при проведении генетического анализа образцы Т. тотсоссит -Ки 104-2 (Япония), Р1 272557 (Венгрия), Р1 13962 (США), Р1 306547 (Румыния) и Р1 277138 (Германия) - были отобраны по результатам предварительного изучения коллекции этого вида [8, 9]. Образцы Ки 104-2, Р1 272557, Р1 13962 имели опушенные колосковые чешуи. Образец Р1 13962 имел черную окраску колоса и был озимым, а образец Р1 306547 также был озимым, но имел белую окраску колоса. Все изученные образцы Т. тотсоссит не имели остевидных придатков на колосковой чешуе.
Остистость, окраску и опушенность колоса, расщепление внутренней колосковой чешуи оценивали визуально, при изучении типа развития -фиксировали число дней от всходов до колоше-
ния. Разделение на яровые-озимые проводили по ранее описанной методике [10]. Озимые образцы T. monococcum, используемые для скрещивания, предварительно яровизировали 40 дней при температуре 4°С.
При изучении биохимических признаков для сравнения T. sinskajae c образцом к-20970 T. monococcum использовали запасные белки (глиадины) и 9 изоферментных систем: 6-фосфоглюконатде-гидрогеназа (6PGD, E.C. 1.1.1.44), глюкозофосфат-изомераза (GPI, E.C. 5.3.1.9), изоцитратдегидроге-наза (IDG, E.C. 1.1.1.42), шикиматдегидрогеназа (SKDH, E.C. 1.1.1.25), алкогольдегидрогеназа (ADH, E.C. 1.1.1.1), ароматическая алкогольде-гидрогеназа, или дегидрогеназа коричного спирта (AADH, Е.С. 1.1.1.90; Е.С. 1.1.1.91), глутамат-дегидрогеназа (GDH, E.C. 1.4.1.2), супероксиддис-мутаза (SOD, E.C. 1.15.1.1), малатдегидрогеназа (MDG, E.C. 1.1.1.37). Анализ запасных белков и изоферментов проводили общепринятыми методами [11, 12]. Компоненты глиадинов даны по В.Г. Конареву [13]. Было проанализировано более 30 индивидуальных зерновок из разных репродукций T. sinskajae. При анализе изоферментов в качестве контроля использовали образцы к-25811 (Армения) и к-14384 (Турция) T. boeoticum Boiss., Ig-45296 (Армения) и Ig-116196 (Турция) T. urartu Thum. ex Gandil., мутант KT3-5 T. monococcum из Японии, К-20970 T. monococcum из Турции и сорт мягкой пшеницы Новосибирская 20 (Новосибирская обл., Россия).
Достоверность отличий фактических данных от теоретически ожидаемых оценивали методом X2 Пирсона. Плотность колоса определяли по формуле D = ((число колосков - 1) х 10)/(длина колоса в см) [14].
Суммарную ДНК растений выделяли стандартным CTAB-методом [15] из 50-170 мг свежих листьев, растертых до состояния пудры в жидком азоте.
Для амплификации фрагмента гена Acc-1 (acetyl-CoA carboxylase) T. sinskajae, а также образцов к-20970, к-18105 (Нагорный Карабах), к-20400 (Германия), G-1777 (Турция) и мутанта KT3-5 T. monococcum были выбраны следующие праймеры:
AcclT (Acc2T)_sense (5'-GGACTTAGTTT-TTTGTCGTCAGTT-3'),
Accl T_antisense (5'-GAAAAAAACGCAGC-CCAATT-3'),
AcclT_antisense_new (5'-CTTCCAAACGTAAG-GACCAATACA-3').
ПЦР-реакцию проводили в 20 мкл реакционной смеси (10-200 нг суммарной ДНК, 65 мМ трис-HCl, pH 8.0, 16 мМ (NH4)2SO4, 0.05% твин-20, 1.5 мМ MgCl2, 0.2 мМ каждого из dNTP, 1 мкМ каждого праймера, 2.5 ед. акт. Гад-полимеразы) при следующем температурном режиме: предва-
а
ю -i
12 3 4 5 6 7 8 91011121314151617
Рис. 2. Электрофоретические спектры глиадина T. sinskajae (дорожка 9) и индивидуальных зерновок образца к-20970 T. monococcum (дорожки 1-8,10—17).
рительная денатурация (94°С, 3 мин) и последующие 30 циклов: денатурация (94°С, 30 с), отжиг праймера (52°С, 42 с), элонгация (72°С, 1 мин).
Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1%-ном агарозном геле (1 х TAE буфер) и выделяли с помощью набора QIAguick Gel Extraction Kit. Очищенные фрагменты секвениро-вали с помощью автоматического секвенатора ABI310A (ABI PRISM 310 Genetic Analyzer) c использованием BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. Полученные нуклеотидные последовательности выравнивали с помощью программы Clustal_X [16].
РЕЗУЛЬТАТЫ
В нашей стране были разработаны методы идентификации образцов пшениц, в том числе и диплоидных видов, с использованием запасных белков эндосперма [13], которые успешно применялись как для их паспортизации, так и для решения филогенетических вопросов. На рис. 2 представлены электрофоретические спектры глиадина T. sinskajae (дорожка 9) и 16 индивидуальных зерновок образца к-20970 T. monococcum (дорожки 1-8,10-17), из которого первый вид был выделен. Образец к-20970 T. monococcum полиморфен по компонентам в ю, у, Р-зонах, в а-зоне полиморфизм не наблюдался. T. sinskajae имеет блоки компонентов, характерные для T. monococcum, в то же время у нее выявлены незначительные различия. На рис. 2 (дорожка 9) стрелкой указаны
12 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920
............ •
12 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920
Рис. 3. Зимограмма 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (а) и глюкозофосфатизомеразы (б) в листьях ди- и гексаплоидной пшениц. Параллельные
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.