УДК 541.138;544.6:57
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СВЯЗЫВАНИЯ ДНК С АЦЕТИЛ- И БЕНЗОИЛ-ЗАМЕЩЕННОЙ СЕЛЕНОМОЧЕВИНОЙ С ИНКОРПОРИРОВАННЫМ ФЕРРОЦЕНОМ
В КАЧЕСТВЕ АНТИОКСИДАНТА © 2015 г. Р. А. Хусейн, А. Бадшах1, К. Акбар
Университет Каид-и-Азам, Исламабад, Пакистан Поступила в редакцию 15.08.2013 г.
Описаны синтез, химическая характеризация, связывание ДНК и антиоксидантная активность (захват 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила) двух соединений селеномочевины с инкорпорированным ферроценом: 1-бензоил-3-(4-ферроценилфенил)селеномочевины и 1-ацетил-3-(4-ферроценилфе-нил)селеномочевины. Эти соединения охарактеризованы методами 1Н и 13С ядерного магнитного резонанса, ИК-спектроскопии с преобразованием Фурье, элементного анализа (определение основного элементного состава органического вещества: углерод, водород, азот, сера) и атомно-абсорб-ционной спектроскопии. Связывание ДНК изучено методами циклической вольтамперометрии, спектроскопии поглощения в УФ- и видимой областях спектра, вискозиметрии и молекулярного допинга. Антиоксидантную активность характеризовали по интенсивности захвата 1,1-дифенил-2-пик-рилгидразила. Константу связывания ДНК вычисляли по уменьшению тока пика продукта присоединения "селеномочевина—ДНК" на циклических вольтамперограммах по сравнению со свободной се-леномочевиной. Константа связывания ДНК у 1-ацетил-3-(4-ферроценилфенил)селеномочевины (4.510 х 104 М-1) меньше, чем у 1-бензоил-3-(4-ферроценилфенил)селеномочевины (7.691 х 104 М-1). Коэффициент диффузии свободной 1-ацетил-3-(4-ферроценилфенил)селеномочевины равен 1.14 х х 10-5 см2 с-1, что больше, чем коэффициент диффузии продукта присоединения "селеномочевина—ДНК" (2.1 х 10-6 см2 с-1); то же наблюдается и в случае 1-бензоил-3-(4-ферроценилфенил)селе-номочевины (5.41 х 10-5 см2 с-1) и продукта присоединения к ней ДНК (4.57 х 10-5 см2 с ). Значение 1С50 (концентрации, обеспечивающей 50% от максимального ингибирования) при захвате 1,1-дифе-нил-2-пикрилгидразила у 1-ацетил-3-(4-ферроценилфенил)селеномочевины (50 мкМ) оказалось меньше, чем у 1-бензоил-3-(4-ферроценилфенил)селеномочевины (130 мкМ).
Ключевые слова: ферроцен, селеномочевина, связывание ДНК, антиоксидант, 1,1-дифенил-2-пик-рилгидразил циклическая вольтамперометрия
Б01: 10.7868/80424857015030081
ВВЕДЕНИЕ
Соединения ацилселеномочевины были синтезированы еще в 1937 г. по реакции аминов с хлоридами карбоновых кислот и селеноцианатом калия [1]. На ранних стадиях эти исследования продвигались не быстро, поскольку в то время селен пользовался дурной славой из-за своей биологической ядовитости, пока в 1957 г. не было обнаружено, что селен является питательным микроэлементом для бактерий, млекопитающих и птиц [2]. В настоящее время производные селена нашли применение в ингибировании ферментов (ингибиторы синтазы оксида азота, инозинмонофос-фатдегидрогеназы, липоксигеназы, уридинфос-форилазы и тимидилатсинтазы, тирозинкиназы и иодотирониндеиодиназы), ферментов защиты от антиоксидантов (восстановление гидроперокси-дов и их имитаторов, восстановление пероксинит-
1 Адрес автора для переписки: aminbadshah@yahoo.com
(А. Badshah).
рилов, перекисное окисление липидов), в качестве ингибиторов роста опухолей, как фототерапевтические агенты, антибактериальные средства (противогрибковые, противовирусные и противобактери-альные), возбудители цитокинов и иммуномодуля-торы, гипотензивные средства, кардиотонические средства и "связыватели" ДНК [3-6]. В особенности соединения селеномочевины показали свою важность в качестве акцепторов свободных радикалов, ингибиторов ферментов и противоопухолевых препаратов [7-10].
В тоже время производные ферроцена проявили себя как противомалярийные средства, антибиотики и противоопухолевые препараты [11]. Установлено, что ферроцен проявляет антибла-стомное действие, но механизм его остается неясным [11, 12]. Исследования взаимодействия ферроцена с ДНК были нацелены на определение механизма противоракового действия производных ферроцена; при этом основывались на убеждении, что если соединение реагирует с ДНК, то
оно может быть использовано для контроля или ослабления аномального разрастания клеток [12]. В настоящей работе нам удалось скомбинировать остатки ферроцена и селеномочевины и получить соединения нового класса: селеномочевина с инкорпорированным ферроценом. Мы описываем здесь синтез 1-бензоил-3-(4-ферроценилфенил)се-леномочевины и 1-ацетил-3-(4-ферроценилфе-нил)селеномочевины и сравниваем их связывание с ДНК (с помощью методов циклической вольтампе-рометрии, спектроскопии поглощения в УФ- и видимой областях спектра, вискозиметрии и "стыковки молекул" — молекулярного допинга ("molecular docking"). Ввиду ожидаемых побочных эффектов антиоксидантов во время лечения рака их обычно запрещают давать пациентам, хотя не очень понятно, нужно их использовать или нет [13]. Поэтому мы также выполнили исследование анти-оксидантной активности этих производных селе-номочевины на примере взаимодействия с ДНК, используя в качестве вещества сравнения аскорбиновую кислоту. Наша идея состоит в том, чтобы применять эти соединения одновременно в качестве противораковых препаратов и антиоксидан-тов, если они успешно пройдут другие испытания для лекарственных препаратов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Точку плавления определяли в капилляре, используя для этого электротермоприбор MP-D (Mitamura Riken Kogyo, Япония). ИК-спектры записывали на спектрометре Thermoscientific NICOLET 6700 FTIR. Спектры 1H и 13C ядерного магнитного резонанса получали с помощью прибора Jeol JNM-LA 500 FT-NMR. В качестве внутреннего стандарта служил Si(CH3)4. Элементный анализ вели на анализаторе LECO-932 CHNS, а концентрацию Fe определяли методом атомно-абсорбционной спектроскопии на спектрофотометре Perkin Elmer 2380.
Коммерческий препарат ДНК лосося солюби-лизировали в дважды перегнанной воде и готовили основной раствор (3.21 х 10-4 М), из которого получали рабочие растворы. Концентрацию основного раствора измеряли по поглощению УФ-света на длине волны 260 нм, используя значение б = = 6600 М-1 см-1. Эта ДНК не содержала белка, поскольку A260/A280 > 1.8 [12]. Растворы лекарственных препаратов для исследований связывания ДНК готовили на водно-этанольной смеси (80 : 20).
Циклические вольтамперограммы снимали на приборе Biologic SP-300, управляемом с помощью программного обеспечения EC-Lab Express V 5.40 (Япония). Перед каждым считыванием данных рабочий электрод полировали порошком оксида алюминия и промывали дистиллированной водой. Индифферентным электролитом слу-
жил перхлорат тетрабутиламмония. Для удаления мешающего кислорода через раствор пробульки-вали азот (99.9%). Циклические вольтамперо-граммы снимали в фосфатном буферном растворе (рН 6) в водно-этанольной смеси (80 : 20).
Вязкость измеряли вискозиметром Ubbelohde при комнатной температуре (25 ± 1°C). Время протекания процесса измеряли цифровым секундомером. Эти измерения повторяли трижды, затем определяли среднее время протекания. Полученные данные представлены в форме зависимости относительной удельной вязкости (п/п0) от числа связывания ([лекарственный препа-рат]/[ДНК]), где п — вязкость ДНК в присутствии комплекса, а п0 — вязкость чистой ДНК [14]).
Восстановительную способность селеномоче-вины определяли с помощью радикала 1,1-дифе-нил-2-пикрилгидразила (ДФПГ) в диметилсуль-фоксидном (ДМСО) растворе; он восстанавливался до 1,1-дифенил-2-пикрилгидразина. К раствору ДФПГ (3.9 мг в 100 мл ДМСО) добавляли исследуемое вещество во все возрастающей концентрации. После каждого добавления измеряли уменьшение поглощения радикала 1,1-дифенил-
2-пикрилгидразила на волне 517 нм с помощью спектрофотометра. Благодаря гиперхромному эффекту, вызванному образованием димерного катион-радикала, уменьшение поглощения в пике на волне 517 нм нарушается, так что значения IC50 здесь определяются скоростью образования этого димерного катион-радикала.
Активность захвата (%) = [(A0 — A)/A0] х 100, где A0 — это поглощение смеси ДФПГ с исследуемым веществом во все возрастающей концентрации, а A — поглощение свободного радикала 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила.
Исследования "стыковки молекул" проводили с помощью программного обеспечения Autodock (версия 4.2) [15]. Структуру додекамера В-ДНК d(CGCGAATTCGCG)2 (1BNA) взяли из базы данных белков [16], а структуры 1-бензоил-3-(4-ферроценилфенил)селеномочевины и 1-ацетил -
3-(4-ферроценилфенил)селеномочевины с минимизированной энергией составляли по программе Avogadro [17], усиленной универсальным полем сил [18]. Эти структуры далее оптимизировали по программе Gaussian 03 [19] (используя теорию функционала плотности, функционал B3LYP [20—22] и базисный комплект 6-311G). Файлы выходных данных от Gaussian 03 применяли в качестве лиганда при последующей стыковке. Необходимые водородные атомы и парциальные заряды Гаштейнера добавляли, пользуясь программой Auto-Dock tools. Шаг координатной сетки по осям x, y и г выбрали равным, соответственно, 66, 64 и 126. Центр координатной сетки установили на 14.98, 20.976 и 8.807 Á. После помещения ДНК в описанную координатную сетку с шагом решетки 0.375 Á рассчитывали координат-
ную сетку карты по программе AutoGrid. Стыковку с макромолекулой проводили, используя эмпирическую функцию свободной энергии и алгоритм Lamarckian Genetic с исходным заполнением 50 отдельных представителей множества, распределенных случайным образом. Применялось максимальное число энергетических оценок 1 х 105 при частоте мутаций 0.02 и частоте кроссовера 0.80. Предполагалось перемещение молекул 1-бензо-ил-3-(4-ферроценилфенил)селеномочевины и 1-ацетил-3-(4-ферроценилфенил)селеномочеви-ны в пределах установленной области для достижения наименьшей энергии конформации, в то время как додекамер В-ДНК во время стыковки жестко закреплялся.
Ферроцен, пара-нитроанилин, нитрит натрия, диэтиловый эфир, ацетон, ДМСО, этанол, паллади-рованный древесный уголь, KSeCN и гидразин были приобретены у компании Sigma-Aldrich. 4-Фер-роцениланилин был синтезирован по методике, ранее описанной нашей группой [23].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.