БИОЛОГИЯ МОРЯ, 2009, том 35, № 2, с. 140-146
УДК 582.272:615.324:543.062 БИОХИМИЯ
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ ВОДНО-ЭТАНОЛЬНЫХ ЭКСТРАКТОВ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ LAMINARIA CICHORIOIDES, COST ARIA COST AT А И FUCUS EVANESCENS1
© 2009 г. Т. И. Имбс, Н. П. Красовская, С. П. Ермакова, Т. Н. Макарьева,
Н. М. Шевченко, Т. Н. Звягинцева
Тихоокеанский институт биоорганической хгшии ДВО РАН, Владивосток 690022 e-mail: technolog@piboc. dvo. ru
Статья принята к печати 20.11.2008 г.
Исследован состав водно-этанольных экстрактов бурых водорослей Laminaria cichorioides, Costaria costata и Fucus evanescens. Экстракты содержали маннит, йод, микроэлементы, свободные аминокислоты, гликолипиды, полиненасыщенные жирные кислоты, фукостерин и полифенолы. Экстракт L. cichorioides отличался высоким содержанием маннита и йода, экстракт С. costata - липофильных веществ, а экстракт F. evanescens - полифе-нольных соединений. Все исследуемые экстракты ингибировали рост раковых клеток кишечника человека DLD-1 и НТ-29. Наиболее сильное ингибирующее действие оказывал экстракт F. evanescens в концентрации 50 мкг/мл. Экстракты могут быть рекомендованы для получения фукостерина, флоротаннинов, производных хлорофилла, маннита и изготовления композиций для медицины и ветеринарии.
Ключевые слова: бурые водоросли, противоопухолевая активность, фукостерин, флоротаннины, маннит, йодсодержащие соединения.
Comparative study of chemical composition and antitumor activity of aqueous-ethanol extracts of brown algae Laminaria cichorioides, Costaria costata and Fucus evanescens. Т. I. Imbs, N. P. Krasovskaya, S. P. Ermakova, T. N. Makarieva, N. M. Shevchenko, T. N. Zvyagintseva (Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far East Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690022)
The chemical composition of water-ethanol extracts of the brown algae Laminaria cichorioides, Costaria costata, and Fucus evanescens was investigated. The algal extracts contained mannitol, iodine, trace elements, free amino acids, glycolipids, polyunsaturated fatty acids, fucosterol, and polyphenols. The extract of L. cichorioides was characterized by high contents of mannitol and iodine; extract of C. costata had great amounts of lipophilic compounds; and extract of F. evanescens, polyphenolic compounds. All the investigated extracts inhibited the growth of human intestinal tumor cells DLD-1 and HT-29. The highest inhibitory effect was found with F. evanescens extract in a concentration of 50 pg/ml. These extracts can be recommended for obtaining fucosterol, phlorotannins, chlorophyll derivatives, and mannitol and for composite preparations for the medicinal and veterinary purposes. (Biologiya Morya, Vladivostok, 2009, vol. 35, no. 2, pp. 140-146).
Key words: brown algae, antitumor activity, fucosterol, phlorotannins, mannitol, iodine-containing compounds.
Бурые водоросли содержат ряд веществ, обладающих биологической активностью. В морских водорослях больше, чем в традиционных пищевых продуктах, как полисахаридов, так и йодсодержащих органических соединений, маннита, макро- и микроэлементов, витаминов, непредельных жирных кислот и других биогенных соединений.
В дальневосточных морях описано около 200 видов бурых водорослей (Гусарова и др., 2000). Многие из них являются массовыми, легко доступными для практического использования объектами, но обладают низкими вкусовыми качествами, поэтому целесообразнее использовать их для получения лечебно-профилактических препаратов, пищевых, косметических и кормовых добавок. Изучение химического состава бурых
водорослей подтвердило наличие в них биологически активных веществ, эффективных при лечении и профилактике различных заболеваний. При исследовании биологического воздействия бурых водорослей выявлена их антиопухолевая активность, которую одни авторы связывают с влиянием сульфатированных полисахаридов - фукоиданов (А1екзеуепко а!., 2007), другие - с присутствием каротиноидов (Ко1аке-Ыага е1 а1., 2001), йодсодержащих соединений (Сапп е1 а1., 2000) или глицерогликолипидов (ОЫа е1 а1., 2001).
Существующие технологии переработки бурых водорослей для получения полисахаридов зачастую предполагают предварительную обработку сырья этанолом (2ууа§т18еуа е1 а!., 1999). Из-за недостаточной изученности химического состава этанольные экстрак-
'Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 06-04-48540) и программы РАН "Молекулярная и клеточная биология".
ты используют, как правило, только для получения маннита, хотя в них содержатся и другие ценные биологически активные вещества. В ряде работ (Funahashi et al., 2001; Вишневская, Подкорытова, 2005) исследованы полезные свойства экстрактов и отдельных компонентов некоторых видов водорослей. Имеются сообщения о биологически активных добавках "Кламин" и "Фитолон" с онкопрофилактическим действием, субстанцией для получения которых послужил экстракт жирорастворимых веществ из бурой водоросли Laminaria saccharina, произрастающей в северных морях (Пат. РФ № 2034560; Пат. РФ № 2031654).
Для расширения области использования бурых водорослей дальневосточных морей кроме полисахаридов необходимо изучать состав и свойства низкомолекулярных веществ водно-этанольных экстрактов. В настоящей работе мы провели сравнительное исследование состава и противоопухолевой активности водно-этанольных экстрактов, полученных при комплексной переработке массовых видов бурых водорослей дальневосточных морей: Costana cosíala [Turn.] Saund, Laminaria cichorioides Miyabe и Fncus evanescens C. Ag.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Использовали свежие водоросли порядка Laminariales, собранные в 2007 г. в б. Троица зал. Петра Великого Японского моря: Costaría costata (время сбора - май, июль) и Laminaria cichorioides второго года развития (май, июль, сентябрь). Кроме того, использована замороженная водоросль порядка Fucales Fucus evanescens, собранная у о-ва Итуруп (Охотское море) в июле 2005 г. Образцы экстрагировали этанолом дважды в течение 3 и 1.5 ч при температуре 40°С (водоросли : этанол, 1 : 0.8 rio массе), при этом получали суммарный экстракт, в котором содержалось 60 ± 5% этанола.
Содержание экстрактивных веществ определяли по стандартной методике (Багирова, Северцев, 2001) в процентах от сухой массы водоросли, отдельных компонентов - в процентах от сухих веществ экстракта. Содержание нейтральных Сахаров в экстракте определяли фенол-сернокислотным методом (Dubois et al., 1956), маннита - модифицированным методом Нэша (Vaskovsky, Isay, 1969), фукоидана и альгиновой кислоты - спектрофотометрически (Усов и др., 2001). Определение массовой доли йода проводили по ранее описанной методике (Кнзеветтер и др., 1967). Содержание тяжелых металлов определяли на атомно-адсорбционном спектрофотометре "Shimadzu АА-6300" (Япония) (Хавезов, Цалев, 1983). Содержание белка определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951), фенольных соединений - по методу Фолина-Чокальте (Van Alstyne, 1995). Качественный и количественный анализ аминокислот проводили на аминокислотном анализаторе "Biochrom-30" (UK) (колонка 200 х 4.6, смола Ultrapac-8 мкм [Li+]), расчет производили путем сравнения площадей пиков исследуемых образцов с площадями пиков стандартной смеси аминокислот "Sigma" (США). Липофильные вещества извлекали из водно-этанольных экстрактов трехкратной промывкой равным объемом хлороформа. Хлороформные фракции объединяли, промывали водой и досуха упаривали на роторном испарителе. Содержание липофильных веществ определяли гравиметрически. Общие липиды разделяли одномерной тонкослойной хроматографией на пластинках с силикагелем (6x6 см). Пластинки элюировали системой C6IVEt20/ СН3СООН (70 : 30 : 1, по объему), высушивали и вновь элюи-
ровали на 25% длины системой СНС1з/СН3ОН/С6Нб/28% NH4OII (65 : 30 : 10 : 6, по объему). Пластинки высушивали, опрыскивали 10% H2S04/Me0H и прогревали при 180°С в течение 10 мин. Затем пластинки сканировали на сканере "Epson Perfection 2400 PHOTO" (Япония), используя программу "Adobe Photoshop" (США). Количество отдельных классов липидов (% от общей суммы) определяли, анализируя полученное видеоизображение с помощью демоверсии программы "Сорбфил ТСХ Видеоденситометр" (Россия). Калибровку проводили по известным стандартам липидов фирмы "Sigma" (США). Состав жирных кислот определяли, как описано ранее (Imbs et al., 2007). Стерины выделяли и анализировали методами газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ), ГЖХ-МС (масс-спектрометрии) и 'Н ЯМР-спектроскопии, как описано ранее (Santalova et al., 2004).
Клетки рака кишечника человека НТ-29 (НТВ-30, АТСС номер) и DLD-1 (CCL-221, АТСС номер) культивировали в инкубаторе при 37°С и 5% С02 в MEM, с добавлением 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 100 ед/л пенициллина и 100 мкг/л стрептомицина. Для определения цитотоксичности экстрактов клетки НТ-29 и DLD-1 (1 х 104/мл) рассеивали в 96-луночные планшеты и культивировали в инкубаторе при температуре 37°С и 5% С02 в 200 мкл 5% MEM в течение 24 ч. Затем клетки обрабатывали экстрактами различной концентрации (10, 50, 100 мкг/мл) и инкубировали в течение 24 ч. После инкубирования в каждую лунку добавляли по 15 мкл 3-(4,5-диметнлсиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолинбромида и помещали в инкубатор (37°С) на 4 ч. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре "Bio-Tek Instruments" (США) при длине волны 570 им (А570).
Противораковый эффект экстрактов бурых водорослей оценивали с использованием метода мягких агаров, как описано ранее (Colburn et al., 1981), с некоторыми модификациями. Клетки рака кишечника человека НТ-29, DLD-1 (8 х 103 клеток/мл) обрабатывали экстрактами с указанными концентрациями в 1 мл 0.33% ВМЕ агара, содержащем 10% FBS поверх 3.5 мл 0.5% ВМЕ агара, содержащего 10% FBS и указанные концентрации экстракта. Клетки культивировали при 37°С и 5% С02 в течение 30 сут. Колонии клеток оценивали с использованием обратимого микроскопа (Motic АЕ 20, Китай) и Motic Image Plus программы (Китай). Для каждого экстракта выполнены две независимые серии э
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.