ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2010, том 434, № 6, с. 846-849
^ ОБЩАЯ
БИОЛОГИЯ
УДК 577.151.54+577.359
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ МЕХАНИЗМОВ ТЕРМОУСТОЙЧИВОСТИ У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ПОПУЛЯЦИЙ GAMMARUS LACUSTRIS SARS, НАСЕЛЯЮЩИХ СОЛЁНОЕ ОЗЕРО ШИРА (РЕСПУБЛИКА ХАКАСИЯ) И ПРЕСНЫЙ ВОДОЕМ ПРИБАЙКАЛЬЯ
© 2010 г. Ж. М. Шатилина, М. В. Губанов, Е. С. Задереев, В. В. Павличенко, Д. В. Аксёнов-Грибанов, Е. А. Сапожникова, М. В. Протопопова, Д. С. Бедулина, М. А. Тимофеев
Представлено академиком И.И. Гительзоном 01.09.2009 г. Поступило 04.06.2010 г.
Виды-космополиты обладают широкой экологической валентностью, благодаря чему способны обитать в самых разных экологических условиях. При этом представители разных популяций, населяющие биотопы с различными, иногда даже контрастными, условиями, могут отличаться резистентностью к тем или иным стрессовым факторам [1].
Механизмы, лежащие в основе вариабельности стресс-адаптации вида, в настоящий момент недостаточно ясны. Известно, что в основе устойчивости к стрессовым факторам лежит комплекс неспецифических реакций на клеточном и молекулярном уровнях [2]. По-видимому, именно различия в их активации и определяют степень стресс-устойчивости.
Целью данной работы было сравнение механизмов терморезистентности (в частности, синтез белка теплового шока БТШ70 и активность антиоксидантного фермента каталазы) у представителей различных популяций вида-космополита, обитающих в контрастных условиях.
Для исследования был выбран типичный представитель видов-космополитов — палеаркти-ческий вид амфипод Оашшаги8 ¡асиз^ 8агз 1863, характеризующийся широкой экологической валентностью [3].
В работе использовали представителей двух популяций О. ¡асиз^, населяющих оз. Шира
Научно-исследовательский институт биологии при Иркутском государственном университете Институт биофизики
Сибирского отделения Российской Академии наук, Красноярск
Сибирский федеральный университет, Красноярск Иркутский государственный университет Байкальский исследовательский центр, Иркутск
(Республика Хакасия, Восточная Сибирь) и мелководное озеро Прибайкальского региона, расположенное в черте г. Иркутск (Восточная Сибирь), в непосредственной близости к р. Ангара.
Озеро Шира — минерализованный (11—15 г/л), меромиктичный водоем, основными катионами которого являются Na, Mg, Ca. Отличительная черта озера — наличие постоянного (непереме-шиваемого) аноксигенного гиполимниона. Градиент температур между верхними и нижними слоями воды в период летней стратификации достигает 20°C, максимальная температура — 24°С и выше [4].
Мелководное озеро в черте г. Иркутск характеризуется слабой минерализацией, неустойчивым газовым режимом. Глубина озера до 2 м. Вода хорошо прогревается летом (до 25°C и выше), зимой же может промерзать практически до дна.
Перед проведением экспериментов амфипод акклимировали при температуре 22(±1)°C (температура воды в озерах в момент вылова рачков). Ак-климацию проводили в воде из мест обитания животных при постоянной аэрации в течение 3—5 сут. Острый температурный стресс индуцировали, помещая рачков в воду с температурой 30°C. Методика острого воздействия имеет широкое распространение при проведении экспериментальных исследований и позволяет с уверенностью оценивать оказываемое воздействие как стрессовое [5, 6]. При остром стрессовом воздействии развитие защитных реакций происходит быстрее и в более выраженной степени.
Определение характера синтеза БТШ70 проводили, используя стандартный метод денатурирующего электрофореза с последующим вестерн-блоттингом с антителами к БТШ70 (monoclonal anti-heat shock protein 70 clone BRM-22, "Sigma Chemical Co."). Полуколичественный анализ содержания белка на мембранах проводили с помощью программы Gel Explorer.
Количество белка, усл. ед.
50 102
45 102
40 102
35 102
30 102
25 102
20 102
15 102
10 102
5 102
0
1
2
Рис. 1. Уровень конститутивного синтеза БТШ70 у представителей различных популяций О. 1асш1;г18. Типовая мембрана (слева) и денситометрический обсчет мембраны (справа). 1 — О. 1асш1и18, Прибайкальский регион; 2 — О. 1асш1г18, оз. Шира.
(а)
К 30 мин 1 ч 3 ч 6 ч
Количество белка, усл. ед.
(б)
К 30 мин 3 ч 6 ч 12 ч
7 103
6 103
5 103
4 103
3 103
2 103
1- 103
0
Контроль 30 мин 1 ч Количество белка, усл. ед.
3 ч
6 ч
12 103
10 103
8 103
6 103
4 103
2 103
0
Контроль 30 мин 3 ч 6 ч 12 ч
Рис. 2. Изменение количества БТШ70 у О. 1асш1г18 разных популяций, экспонированных при температуре 30°С. Типовая мембрана (слева) и денситометрический обсчет мембраны (справа). а — популяция Прибайкальского региона; б — популяция оз. Шира.
Активность каталазы измеряли в соответствии с методикой [7] с добавлением перекиси водорода при длине волны 240 нм и рН 7.
При экспонировании амфипод при 30°С у представителей популяции Прибайкальского региона гибель 50% особей отмечали уже через 7.5 ч, гибель 100% особей наступала через 11 ч; у пред-
ставителей популяции оз. Шира гибель 50% особей отмечена через 1 сут, 100% — через 1.5 сут.
У амфипод обеих популяций отмечали конститутивный синтез белка семейства БТШ70 с молекулярной массой около 70 кДа. При этом у представителей популяции Прибайкальского региона содержание БТШ70 у особей контрольных групп
848
500-
400-
св М ч о
ю 300-
1-С
н
ЕЙ 200-я
100-
ШАТИЛИНА и др.
Ш П2
Контроль 30 мин
1 ч
3 ч
6 ч
12 ч
Рис. 3. Активность фермента каталаза у О. 1асш1х18 из различных популяций, экспонированных при температуре 30°С. 1 — популяция Прибайкальского региона, 2 — популяция оз. Шира.
0
было выше, чем у представителей популяции оз. Шира (рис. 1).
Температурный стресс у рачков популяции Прибайкальского региона уже через 30 мин вызывал незначительное увеличение содержания БТШ70 (рис. 2а). Далее по ходу эксперимента содержание БТШ70 постепенно увеличивалось. Максимальный уровень исследуемого белка наблюдали к окончанию эксперимента (6 ч).
У рачков популяции оз. Шира увеличение содержания БТШ70 происходило через 3 ч экспозиции (рис. 2б). Максимальное содержание БТШ70 наблюдали у животных, экспонированных 6 ч.
Активность каталазы у рачков контрольных групп разных популяций различалась — у представителей популяции Прибайкальского региона она составила 202 ± 15 нкат/мг белка, у представителей популяции оз. Шира — 356 ± 64 нкат/мг белка.
Экспонирование представителей популяции О. 1аси8М8 Прибайкальского региона при 30°С вело к достоверному росту активности каталазы уже через 1 ч экспозиции (рис. 3), далее по ходу эксперимента рост активности фермента продолжался. У представителей популяции оз. Шира отмечали тенденцию к снижению активности ката-лазы (рис. 3).
Показанные различия в уровнях конститутивного синтеза БТШ70, а также в характере и степени увеличения его количества у представителей разных популяций вида-космополита, вероятно, обусловлены различиями условий их обитания. Известно, что при изменении солености среды для предотвращения значительных изменений в ионном составе клеток организмам необходимо поддерживать ионный баланс. Существуют различные стратегии водно-солевой регуляции [8].
Несмотря на то, что большинство ракообразных имеют хорошо развитые механизмы осморегуля-ции [9], обитание в среде с разной соленостью может приводить к сдвигу в ионном балансе как в целом организме, так и в клетках. Ионный баланс в клетке, как и ряд других воздействий (электростатическое, Ван-дер-Ваальс—Лондона, гидрофобные взаимодействия и др.), оказывает влияние на стабильность белковой молекулы за счет воздействия на нековалентные связи в структуре белка [10]. Несмотря на то, что стабильность белковой молекулы в первую очередь определяется последовательностью и составом входящих в нее аминокислот, ее функциональные свойства зависят также от конформационного состояния. Ионы, присутствующие в среде, за счет их участия в перераспределении зарядов в белковой молекуле могут либо увеличивать, либо снижать стабильность ее третичной структуры, в том числе и термостабильность. Более низкий конститутивный уровень БТШ70 у представителей популяции оз. Шира, вероятно, связан с тем, что наличие минеральных солей в среде обитания вызывает стабилизацию клеточных белков, в результате чего не требуется большого количества данного белка для поддержания белкового гомеостаза. Для подтверждения данной гипотезы требуются дальнейшие исследования.
Увеличение количества исследуемых БТШ в ответ на температурный стресс в нашей работе указывает на то, что происходит нарушение структуры и функций клеточных белков, так как БТШ вовлечены в поддержание правильной кон-формации других клеточных белков [11]. При этом более медленное увеличение количества БТШ70 у представителей популяции минерализованного оз. Шира происходит, вероятно, вслед-
ствие большей стабильности большинства их клеточных белков.
В работе показано, что активность каталазы у представителей контрольных групп популяции оз. Шира выше, чем у представителей популяции Прибайкальского региона. Известно, что увеличение солености среды вызывает образование активных форм кислорода (АФК) в клетках и приводит к оксидативному стрессу [12]. Каталаза является элементом антиоксидантной системы (АОС) и направленно утилизирует АФК [13]. Вероятно, при обитании в минерализованной воде необходима более высокая активность АОС вследствие постоянного оксидативного стресса, что и отмечено для представителей популяции минерализованного оз. Шира.
В работе показано, что температура 30°С оказывает влияние на активность каталазы. У представителей популяции Прибайкальского региона отмечена активация фермента, в то время как у представителей популяции оз. Шира обнаружено снижение его активности.
Известно, что температурный стресс индуцирует образование АФК в клетках [13]. Таким образом, повышение активности каталазы у представителей популяции Прибайкальского региона свидетельствует о температурно-индуцирован-ном образовании АФК, в результате чего необходима активация механизмов, их утилизирующих. Снижение активности исследованного фермента у представителей популяции оз. Шира, вероятно, также с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.