ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ ФИЗИЧЕСКАЯ, 2013, том 77, № 6, с. 813-818
УДК 538.9:547.96
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НАНОРАЗМЕРНЫХ "ЖЕЛЕЗНЫХ ЯДЕР" В ФЕРРИТИНЕ ПЕЧЕНИ ЧЕЛОВЕКА И ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ВАЖНЫХ МОДЕЛЯХ -
ПРЕПАРАТАХ МАЛЬТОФЕР® И ФЕРРУМ ЛЕК, МЕТОДОМ МЁССБАУЭРОВСКОЙ СПЕКТРОСКОПИИ © 2013 г. И. В. Аленькина1, М. И. Оштрах1, В. А. Семенкин1, Э. Кузманн2
E-mail: alenkina-ira@mail.ru
Проведено исследование образцов ферритина печени человека и его моделей — фармацевтически важных препаратов Мальтофер® и Феррум Лек, методом мёссбауэровской спектроскопии с высоким скоростным разрешением при 295 и 90 К и с низким скоростным разрешением при 40 и 20 К. Проведенная аппроксимация спектров многокомпонентной моделью подтверждает предположение о сложной гетерогенной структуре наноразмерных "железных ядер" в исследуемых образцах.
DOI: 10.7868/S0367676513060033
ВВЕДЕНИЕ
Атомы железа играют важную роль в биологических процессах и входят в состав многих жизненно важных биомолекул, выполняющих ферментативные, транспортные и накопительные функции [1]. Основным белком в живых системах, который запасает железо, является водорастворимый белок ферритин, состоящий из белковой оболочки, внутри которой находится нано-размерное "железное ядро". Внешний диаметр белковой сферы и диаметр "железного ядра" составляют 12 и 6—8 нм соответственно. "Железное ядро" ферритина представляет собой полиядерный комплекс оксигидроокиси железа в форме ферри-гидрита с примерной формулой (5Ре203 • 9Н20) или (Бе00Н)8(Ре0 : ОРО3Н2) и интенсивно изучается различными методами, однако его реальная структура до сих пор не ясна [2—6]. Дефицит железа в организме приводит к анемии — заболеванию, широко распространенному во всем мире: недостаток железа наблюдается более чем у миллиарда человек и более чем у 700 миллионов — же-лезодефицитная анемия [7]. Одними из наиболее эффективных препаратов для лечения железоде-фицитных анемий оказались модели ферритина. Эффективность их применения, вероятно, связана со схожестью с биологическим аналогом — молекулой ферритина [8, 9]. Эти препараты содержат "железные ядра", близкие по структуре к
1 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Уральский федеральный университет имени Первого президента России Б.Н. Ельцина", Екатеринбург.
2 Институт химии, Университет им. Л. Этвеша, Будапешт, Венгрия.
P-FeOOH, окруженные различными полисахаридами, например, декстрином, декстраном, полимальтозой.
Ранее была предложена модель "железного ядра" в ферритине, предполагающая наличие двух областей: внутренней антиферромагнитной области с температурой магнитного фазового перехода TN ~ 310 К и внешнего аморфного слоя с более низким значением TN, получившая название "core-shell model" [10]. На основании данной модели мёссбауэровские спектры ферритина были аппроксимированы двумя компонентами (парамагнитными при высоких температурах и магнитными при низких) [11—14]. Однако некоторые авторы показали возможность аппроксимации мёссбауэровских спектров ферритина и его моделей с использованием большего числа компонент [14—17]. Более того, недавно была предложена многофазная модель "железного ядра" фер-ритина следующего состава: 60—80% ферригид-рита, 15—25% магнетита и/или маггемита, 1—10% гематита [18]. В настоящей работе проведено сравнительное исследование ферритина и его фармацевтически важных моделей методом мёсс-бауэровской спектроскопии в широком температурном диапазоне с целью дальнейшего изучения структурных особенностей их наноразмерных "железных ядер".
1. МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
Ферритин из печени человека в лиофильно высушенной форме был получен в Российском государственном медицинском университете (методика описана в [19]). Для проведения экспериментов 100 мг белка помещалось в специальную оправку
из оргстекла диаметром 20 мм. В качестве моделей ферритина использовались промышленно производимые фармацевтические препараты Мальто-фер® (Vifor, International Inc., Switzerland) и Фер-рум Лек (Lek, Slovenia). Мальтофер® и Феррум Лек представляют собой комплекс железа с полимальтозой и содержатся в таблетках по 100 мг железа в каждой. Для проведения измерений использовали по 1/3 таблетки, которую измельчали до порошкообразного состояния и помещали в оправки из оргстекла. Эффективная толщина образцов составляла ~10 мг Fe • см-2.
Измерения при 295 и 90 К проводились на автоматизированном прецизионном мёссбауэров-ском спектрометрическом комплексе с высоким скоростным разрешением (регистрация в 4096 каналов), созданном на базе мёссбауэровского спектрометра СМ-2201 и модернизированного криостата с движущимся поглотителем в диапазоне температур 295-85 К (криостат — разработка НИИ физики Южного федерального университета, Ростов-на-Дону) [20—22]. Источник мёссбауэ-ровского излучения 57Со в матрице родия активностью ~1.8 • 109 Бк (RITVERC GmbH, Санкт-Петербург) находился при комнатной температуре. Для калибровки скоростной шкалы спектрометра использовался стандартный поглотитель нитро-пруссид натрия (SNP) с эффективной толщиной 5 мг Fe • см-2 (ширина линии 0.229 ± 0.003 мм • с-1, значение эффекта ~12%). Длительность измерения составляла от двух до четырех дней, за это время достигалась величина статистического набора от 3.1 • 105 до 1.1 • 106 импульсов в канале при регистрации в 4096 каналов. Скоростное разрешение составило ~0.0012 мм • с-1 на канал, соотношение сигнал/шум составило от 96 до 134.
Дополнительно мёссбауэровские спектры были измерены при 40 и 20 К с низким скоростным разрешением (регистрация в 256 каналах как на прямом, так и на обратном ходе системы движения) на спектрометре типа KFKI с опорным сигналом скорости треугольной формы и с гелиевым рефрижератором замкнутого цикла APD. Длительность измерения составила 1-2 сут, за это время достигалась величина статистического набора от 1.6 • 105 до 1.6 • 106 импульсов в канале при регистрации в 250 каналов. Скоростное разрешение составило ~0.11 мм • с-1, соотношение сигнал/шум - от 31 до 55. Для аппроксимации использовались спектры, измеренные в 256 каналах только на прямом ходе системы движения (без фолдинга). Для контроля спектрометра был использован тот же стандартный поглотитель нитро-пруссид натрия (SNP) с эффективной толщиной 5 мг Fe • см-2 (ширина линии 0.23 ± 0.05 мм • с-1, величина эффекта ~3.5%).
Все спектры были аппроксимированы по программе UNIVEM-MS (разработка НИИ физики
Южного федерального университета, Ростов-на-Дону) методом наименьших квадратов с использованием линии лоренцевой формы. Для каждого спектра определялись следующие параметры: изомерный сдвиг 8, квадрупольное расщепление (квадрупольный сдвиг для магнитно расщепленных компонент) AEq, магнитное сверхтонкое поле, Hf, ширина линии Г, относительная площадь компонент S. Для оценки качества аппроксимации использовались разностный спектр, статистический критерий х2 и физический смысл параметров. При оценке мёссбауэровских параметров учитывались два типа ошибок: инструментальные и расчетные. Инструментальная (систематическая) ошибка для каждой точки спектра составляет ±0.5 канала по шкале скоростей, для оценок значений сверхтонких параметров инструментальная (систематическая) ошибка составляет ±1 канал в единицах скорости, для ширины линии — ±2 канала в единицах скорости [22]. После сравнения расчетной и инструментальной (систематической) ошибок для оценок параметров приводилось наибольшее значение ошибки. Ошибка в определении относительной площади не превышала 10 %. Все изомерные сдвиги приводятся относительно a-Fe при 295 К.
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Мёссбауэровские спектры образцов ферритина, препаратов Мальтофер® и Феррум Лек, измеренные при 295 и 90 К с высоким скоростным разрешением, имеют вид дублета и визуально отличаются только по величине эффекта, а значит, и по содержанию железа в образцах (рис. 1). Поскольку форма линии мёссбауэровских спектров оксидов и оксигидроксидов Fe(III) является не-лоренцевой [23, 24], спектры исследуемых образцов были аппроксимированы с помощью модели гетерогенного "железного ядра", подробно описанной в [16, 25, 26], с использованием суперпозиции нескольких квадрупольных дублетов. Необходимо отметить, что спектры одного и того же образца, измеренные при 295 и 90 К, аппроксимировались согласованной моделью, при этом некоторые параметры (интенсивность и/или ширина линии) фиксировались. Максимальное число компонент, необходимое для наилучшей аппроксимации мёссбауэровских спектров, измеренных при 295 и 90 К, оказалось различным: 4 для ферритина, 5 для препаратов Мальтофер® и Феррум Лек.
Мёссбауэровские параметры, полученные в результате наилучшей аппроксимации, приведены в таблице. Сравнение площадей соответствующих компонент в мёссбауэровских спектрах образцов, измеренных при 295 и 90 К, показано на рис. 2. Видно, что почти все полученные значения относительных площадей спектров для соответ-
Рис. 1. Мёссбауэровские спектры ферритина печени человека (а, б) и его фармацевтических моделей — препаратов Мальтофер® (в, г) и Феррум Лек (д, е), измеренные при 295 К (а, в, д) и 90 К (б, г, е) с высоким скоростным разрешением (4096 каналов). Указанные компоненты получены в результате наилучшей аппроксимации.
S, %
Эффект, % а
1.6 -0.8 0 0.8 1.6
-2-10 1 2
1.6 -0.8
2 -1 0 1 2
0 2 4 6 8 10
2 -1 0 1 2
к
2,
-2-10 1 2
Скорость, мм • с-1
1
в
1
1
г
2
ствующих компонент не отличаются в пределах ошибки. Однако наблюдается увеличение ширин линий соответствующих компонент спектров при понижении температуры до 90 К, что, в частности, может быть следствием вибраций в криоста-те, возникающих при поступлении жидкого азота (см. [21]).
Достижение наилучшей аппроксимации мёсс-бауэровских спектров исследуемых образцов с использованием нескольких компонент указывает на сложную гетерогенную структуру нанораз-мерных "железных ядер". Эти компоненты могут быть связаны с различными областями и/или слоями "железного ядра", различающимися по степени кристалличности (аморфности), плотности упаковки атомов, с наличием одного или нескольки
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.