БИОФИЗИКА, 2013, том 58, вып. 6, с. 961-974
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА=
УДК 577.32
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ АМИЛОИДНЫХ СВОЙСТВ
МЫШЕЧНЫХ БЕЛКОВ И Ар-ПЕПТИДОВ МОЗГА И ПОДХОДОВ К РАЗРУШЕНИЮ ИX АМИЛОИДОВ in vitro
© 2013 г. А.Г. Бобылёв*, Л.Г. Бобылёва*, И.М. Вихлянцев*, А.Д. Уланова* **,
Н.Н. Салмов*, З.А. Подлубная* **
*Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, ПущиноМосковской области, ул. Институтская, 3; **Пущинский государственный естественно-научный институт, 142290, Пущино Московской области, просп. Науки, 3 E-mail: bobylev7@rambler.ru Поступила в p едакцию 31.01.13 г. Посте доpаботки 05.06.13 г.
В обзоpе пpедcтавлены cобcтвенные данные cpавнительного изучения амилоидных cвойcтв белков cемейcтва тайтина и АР-пептидов мозга. Описаны подxоды к pазpушению амилоидные фибpилл мышечного X-белка и АР(1-42)-пептида мозга c помощью pазличныx xимичеcкиx соединений.
Ключевые слова: амилоиды, амилоидозы, белки семейства тайтина, фуллерены, цитотоксичность, производные фуллерена Сбо.
Амилоидные агрегаты являются основным признаком амилоидозов - конформационных болезней человека и животных, наступающих в результате наследственного или приобретенного нарушения сворачивания белка. Амилоидные агрегаты можно разделить на два класса: амилоидные фибриллы, представляющие собой высо-коупорядоченные структуры и аморфные агрегаты, не имеющие упо рядоченной структуры. Известно, что амилоидные агрегаты имеют ряд специфических тинкториальных и физико-химических характеристик: способность связываться с красителями Конго красным и тиофлавином Т, высокое содержание в-складчатой структуры, двойное лучепреломление в поляризованном свете, нерастворимость в большинстве растворителей и устойчивость к протеазам [1-3]. Амилоиды играют центральную роль в патогенезе болезней, от которых страдают миллионы людей (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, диабет второго типа, прионные болезни, системные ами-лоидозы и др.) [1,2,4-6]. П ри этом наследственные амилоидозы составляют небольшую часть, в основном же встречаются спорадические формы. Амилоидные отложения (агрегаты) обнаружены в сосудах, в сердечной и скелетной мускулатуре при миокардитах, миозитах, кардиомиопатиях, включая и амилоидную кардиомиопатию [7,8]. Молекулярные механизмы амилоидозов до конца
не изучены. Иx выяснение необходимо для предупреждения амилоидозов, их ранней диагностики и назначения своевременного эффективного лечения. Для решения этих задач используются разные подходы, в том числе экспериментальное моделирование, а также изучение амилоидогенеза in vitro в системах разных белков.
За процессом амилоидогенеза можно наблюдать с помощью классического амилоидного красителя тиофлавина Т, который взаимодействует с амилоидными фибриллами [9]. При этом происходит увеличение интенсивности флуоресценции красителя при спектрофлуори-метрических измерениях и наблюдается желто -зеленая флуоресценция при флуоресцентно-микроскопических исследованиях. Авторы работы [9] показали, что молекула тиофлавина Т связывается с амилоидами специфически. Было предположено, что связывание происходит в «каналах», которые тянутся вдоль Р-слоев. Тио-флавин Т связывается с амилоидами таким образом, что его молекулы ложатся параллельно друг другу и расположены вдоль длинной оси фибриллы [9]. Было показано, что причиной возра стания интенсивности флуор есценции тиофлавина Т при его связывании с амилоидами является жесткость окружения, препятствующая повороту бензтиазольного и аминобензольного
колец его молекулы друг относительно друга в возбужденном состоянии [10].
Другой амилоидный краситель - Конго красный - также специфически взаимодействует с амилоидами [11]. Конго красный - сульфониро-ваный азокраситель с гидрофобной центральной частью, состоящей из бифенильной группы, расположенной между отрицательно заряженными концами молекулы красителя. При связывании Конго красного с амилоидами наблюдается двойное лучепреломление в поляризационном микроскопе, что позволяет использовать этот краситель для выявления амилоидов. П ри спектральных исследованиях Конго красного, связанного с амилоидами, регистрируется сдвиг спектра поглощения в длинноволновую область от ~490 нм к ~500 нм. Связывание амилоидных фибрилл с Конго красным также зависит от наличия в-складчатой структуры с отдельными в-слоями.
Описанные методы позволяют получать необходимые данные об амилоидном потенциале исследуемого белка, а также оценить подходы к разрушению амилоидов.
Известно уже более 50 белков, способных формировать амилоидные агр егаты, и это количество будет продолжать расти. Данный обзор посвящен изучению амилоидных свойств у группы мышечных белков семейства тайтина.
В настоящее время не существует кардинальных способов лечения амилоидозов. Используемые лекарственные препараты приносят больным лишь временное облегчение, не решая основной проблемы, связанной с накоплением амилоидных агрегатов. На сегодняшний день из всех возможных подходов для коррекции амилоидозов широкое распространение получила разработка способов замедления или пр е-дотвращения агрегации амилоидных белков, а также разрушения уже имеющихся агрегатов. Поэтому отдельной задачей наших исследований было изучение способности разных соединений влиять на агрегацию амилоидных белков.
ИЗУЧЕНИЕ АМИЛОИДНЫХ СВОЙ СТВ МЫШЕЧНЫХ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА ТАЙТИНА
В 1985 г. П. Беннет с соавторами, изучая структуру С- и Х-белков, обнаружили, что мышечный Х-белок в растворе, содержащем 30 мМ КС1 и 10 мМ имидазола, способен образовывать спирально-скрученные ленточные фибриллы [12]. Мы предположили, что данные структуры X-белка могут иметь амилоидную природу, что и было подтверждено в наших дальнейших исследованиях с использованием люминесцентной, поляризационной микроскопии и спектральных ме-
тодов [13]. В дальнейших наших исследованиях были обнаружены амилоидные свойства еще у трех цитоскелетных мышечных белков семейства тайтина (тайтин, C-белок и Н-белок) [14]. C помощью электронной микроскопии было показано [15,16], что исследуемые нами белки семейства тайтина, как и другие известные амилоидные белки [17], способны формировать различные амилоидные агрегаты: аморфные агрегаты, протофибрил-лы, спирально скрученные ленты, линейные фибриллы и их пучки (рис. 1). Амилоидная природа наблюдаемых агрегатов белков семейства тайтина из скелетных и сердечных мышц была подтверждена поляризационной и люминесцентной микроскопией, а также спектральными методами с использованием красителей Конго красного и тио-флавина Т [15,16,18]. Интенсивность флуоресценции тиофлавина Т в присутствии амилоидных фибрилл X-, Н-, C-белков и тайтина возрастала приблизительно в 10, 9, 7 и 5 раз соответственно по сравнению с интенсивностью флуоресценции красителя при нахождении этих белков в молекулярной форме [15,16]. П ри измерении спектральных характеристик раствора Конго красного в присутствии фибрилл тайтина, X-, C- и Н-белков также наблюдался сдвиг спектра поглощения красителя в длинноволновую область от ~490 нм к ~500 нм [15,16], что подтверждало специфичность связывания данных амилоидных фибрилл с красителем [11]. Высокое (~90%) исходное содержание в-складчатости в структуре молекул этих белков, по-видимому, позволяет быстро формировать амилоиды в условиях, близких к физиологическим.
При электронно-микроскопическом сравнении амилоидных фибрилл X-белка с амилоидными фибриллами Ав-пептидов было обнаружено их морфологическое сходство (рис. 2). В частности, Ав(1-42)-пептид (р ис. 2а,б) образует спирально скрученные ленты несколько микрон длиной и диаметром 25-27 нм с вариабельным осевым периодом 170-250 нм, которые морфологически схожи с фибриллами X-белка (рис. 1г).
Таким обр азом, результаты наших исследований показали, что белки семейства тайтина поперечнополосатых мышц формируют амилоиды in vitro в достаточно мягких условиях (рН 7,0, темпер атура 5-37°C, ионная сила, близкая к физиологической). Вполне вероятно, что эти белки могут быть потенциальной причиной амилоидозов in vivo.
ПОДХОДЫ К РАЗРУШЕНИЮ АМИЛОИДНЫ X ФИБРИЛЛ И П РЕДОТВРАЩЕНИЮ И X ОБРАЗОВАНИЯ
В настоящее время не существует препара -тов, которые способны избирательно разрушать
амилоидные фибр иллы, не повреждая фибр ил-лы нормальных белков и не оказывая токсического действия. Это в первую очер едь относится к традиционным пр епаратам, используемым пр и терапии болезней Альцгеймера и Пар-кинсона, таким как аксамон, мидантан, акати-нол и др., мишенью которых являются не амилоиды. Существуют подходы к замедлению агрегации амилоидов, применимые только для конкретного заболевания. Например, при терапии болезни Альцгеймер а существуют способы снижения уровня Ав-пептидов путем селективного ингибирования ферментов, ответственных за их наработку в организме.
Основным компонентом амилоидов, образующихся при болезни Альцгеймера, являются гидрофобные пептиды (Ав-пептиды) [19]. За наработку токсичных Ав-пептидов отвечают два мембранных фермента: в-секретаза, также известная как в-site of APP deaving enzyme (BACE1), и у-секр етаза, представляющая собой мультиферментный комплекс [20], состоящий из пяти субъединиц (Pen-2, Presinilin 1 или Pre-sinilin 2, Nkastrin, АрЬ1В). Ингибиторы у-сек-ретазы известны, однако данный комплекс является мультиферментным и катализирует образование нескольких пептидов, например сигнальный пептид Notdil, отвечающий за такие важные клеточные процессы, как рост и про -лифер ация [21]. К роме того, нокаут гена, отвечающего за синтез субъединицы у-секретазы Presenilin 1, которая непосредственно отвечает за наработку Ав-пептида, вызывал гибель мышей уже на стадии эмбриона. Ингибирование всего ферментного комплекса у-секретазы неселективными ингибиторами приводило к различным нарушениям, связанным с образованием Notch1 (ра сстр ойство ЖКТ, нарушение ра -боты иммунной системы и кожные патологии) [22]. Существуют работы, в которых авторы говорят о том, что им удалось найти ингибитор у-секретазы, при действии которого не наблюдалась токсичность, связанная с N
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.