ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 2, с. 176-182
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА
УДК 577.321:577214:57.052
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ НАТИВНОГО И ГИБРИДНОГО ГЕНА АЦИЛ-ЛИПИДНОЙ А9-ДЕСАТУРАЗЫ
В БАКТЕРИИ Escherichia coli
© 2007 г. Р. Маали1, 3, X. Р. Шимшилашвили1, В. П. Пчёлкин2, В. Д. Цыдендамбаев2, А. М. Носов2, 3, Д. А. Лось2, И. В. Голденкова-Павлова1
1 Институт общей генетики им. НИ. Вавилова Российской академии наук, Москва 119991; факс: (495) 132-89-62; e-mail: irengold@vigg.ru 2 Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва 127276 3 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, кафедра физиологии растений, Москва 119992 Поступила в редакцию 10.07.2006 г.
Изучали экспрессию гена desC, кодирующего ацил-липидную А9 -десатуразу у термофильной ци-анобактерии Synechocystis sp. PCC6803, в клетках Escherichia coli. Сконструирован гибридный ген desC-licBM3, в котором последовательность нативного гена ацил-липидной А9-десатуразы слита в рамку считывания с репортерным геном, кодирующим термостабильную лихеназу. Показано, что присутствие лихеназы в составе гибридного белка облегчает проведение отбора и анализа уровня экспрессии мембранной десатуразы в гетерологичном хозяине. Сравнительный анализ экспрессии нативного и гибридного генов в клетках бактерий показал, что лихеназа в составе гибридного белка сохраняет активность и термостабильность, а десатураза - способность катализировать введение двойной связи в соответствующее положение цепи остатка жирных кислот.
Живые организмы способны приспосабливаться к изменяющимся условиям окружающей среды, используя различную стратегию адаптации [1]. Мембраны обладают свойством текучести, которая, изменяясь под действием различных физических и химических воздействий, обеспечивает адаптивные перестройки в мембране и изменение активности мембраносвязанных белков, воспринимающих и передающих внешние сигналы [2]. Физические свойства липидов в мембранном бислое в большой степени определяются уровнем их ненасыщенных жирных кислот (ЖК), т.е. количеством двойных связей, образуемых де-сатуразами [1]. Так, в ответ на понижение температуры в холоднокровных организмах индуцируется экспрессия десатураз ЖК, запускается механизм десатурации и увеличивается степень ненасыщенности ЖК в липидах мембран [3, 4]. Десатуразы - строго специфичные ферменты, катализирующие образование двойных связей в цепях ЖК [4]. Десатуразы ЖК были обнаружены практически во всех организмах, за исключением некоторых бактерий, например Escherichia coli [4].
Десатуразы ЖК делят на три типа: ацил-ли-пидные, ацил-АПБ и ацил-КоА. Ацил-липидные десатуразы катализируют большинство реакций десатурации у растений и все реакции десатурации у цианобактерий. Это интегральные мембранные ферменты, образующие двойные связи в остатках ЖК, входящих в состав липидов [4].
Ацил-липидная Д9-десатураза цианобактерии Synechocystis - это фермент, который вводит первую цис-Д9-двойную связь в остаток насыщенной жирной кислоты независимо от длины ее углеродной цепи [5]. Образование первой двойной связи в цепи ЖК играет наиболее важную роль в изменении физических свойств мембранных липидов [6]. Кроме того, Д9-десатураза обеспечивает субстратом остальные ферменты, последовательно образующие вторую (Д12), третью (Д6 или ю3) и четвертую (w3) двойные связи.
Изучение условий, в которых индуцируются и экспрессируются гены десатураз, важно для понимания механизмов адаптации биологических мембран и организмов в целом. Липидный состав мембран, а также степень ненасыщенности ЖК варьируют в широких пределах при изменениях температуры, света, диеты, концентрации солей и осмотических веществ [7-9].
Данное исследование посвящено сравнительному изучению экспрессии нативного и гибридного генов Д9-десатуразы цианобактерий в Escherichia coli. Поскольку мембранные белки не всегда эффективно экспрессируются в клетках E. coli и активность десатураз можно обнаружить лишь по изменению состава ЖК, для обнаружения ре-комбинантных десатураз мы использовали технологию слияния целевого гена с последовательностью гена, кодирующего репортерный белок. В
Таблица 1. Праймеры, использованные в работе
Праймер Последовательность (5'-3')
LicBM3 sense XhoI LicBM3 antisense SphI LicBM3 sense BamHI desC sense BglII desC antisense XhoI desC sense BglII (pET) CTCGAGGTGGTAAATACGCCTTTTG GCATGCGTTAGGATAGTATTTTACATATTCG GGATCCGTGGTAAATACGCCTTTTG AGATCTACATCATCCTTAGAATTGCAACC CTCGAGTTCGGACAACGCTTTG AGATCTCACATCATCCTTAGAATTGCAACC
качестве репортера была выбрана термостабильная лихеназа Clostridium thermocellum [10].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериальные штаммы. В работе использованы: штамм E. coli XLlblue ("Stratagene", США) F'::Tn10tet, proA+B+, lacIQ,D(lacZ)M15/recA1, endAl, gyrA96, thi,hsdR17, (rk-mk+), supE44, relA1,lac;
штамм BL21(DE3) ("Novagene", США) F- dcm ompT hsd S( rb-m ) gal Ä,(DE3).
Плазмиды. Для процедур молекулярного клонирования использовали плазмиды pGEM-T ("Prome-ga", США) и экспрессионные векторы pQE и pET22b(+) ("Clontech", США).
Конструирование бактериальных экспресси-онных векторов. В работе использовали стандартные процедуры молекулярного клонирования и протоколы ПЦР [11]. Эндонуклеазы рестрикции, Т4 ДНК-лигазу, P/u-ДНК-полимеразу использовали согласно протоколам фирм-изготовителей ("Promega", США, и "Fermentas", Литва).
Последовательность репортерного гена ñcBM3 получали с помощью ПЦР с использованием в качестве матрицы плазмиду pQE-30-ñcBM2-KM2-Mys25, полученную ранее [12], и праймеры LicBM3 sense BamHI и LicBM3 antisense SphI (табл. 1). Амплифицированный фрагмент клонировали в плазмиду pGEM-Т с образованием плазмиды pGEM-//cBM3-1. Далее, BamHI-SphI фрагмент плазмиды pGEM-//cBM3-1 клонировали в вектор pQE-30, предварительно гидролизован-ный ферментами BamHl и SphI, с образованием экспрессионного вектора pQE-//cBM3.
Последовательность нативного гена desC получали ПЦР, используя геномную ДНК Syne-chocystis sp. PCC6803 в качестве матрицы и праймеры desC sense BgllI и desC antisenseXhoI ("Евро-ген", Россия) (см. табл. 1). Амплифицированный фрагмент гена desC клонировали в вектор pGEM-T с образованием плазмиды pGEM-desC. Затем Bg/II-SphI-фрагмент плазмиды pGEM-desC клонировали в вектор pQE-30, предварительно гидро-
лизованный ферментами BamHI и SphI, с образованием экспрессионного вектора pQE-desC.
Конструирование экспрессионного вектора pQE-desC-licBM3 было проведено в несколько этапов. Первоначально методом ПЦР был получен фрагмент репортерного гена термостабильной лихеназы с использованием в качестве матрицы плазмиды pQE30-licBM2-KM2-Mys25 и прай-меров LicBM3 sense XhoI и LicBM3 antisense SphI (табл. 1), который был клонирован в плазмиду pGEM-T с образованием плазмиды pGEM-licBM3-2. Затем XhoI-SphI-фрагмент плазмиды pGEM-licBM3-2 был клонирован в плазмиду pGEM-desC, предварительно гидролизованную ферментами XhoI и SphI, с образованием плазмиды pGEM-desC-licBM3. Далее, Bg/II-SphI-фрагмент плазмиды pGEM-desC-licBM3 был клонирован в вектор pQE-30, предварительно гидролизованный ферментами BamHI и SphI, с образованием экспрессионного вектора pQE-desC-licBM3.
Конструирование экспрессионных векторов pET-licBM3 и pET-desC проводили в несколько этапов. Первоначально, используя праймеры desC sense BglII (pET) и desC antisense XhoI и геномную ДНК Synechocystis sp. PCC6803 в качестве матрицы, проводили ПЦР. Амплифицированный фрагмент клонировали в плазмиду pGEM-T с образованием плазмиды pGEM-desC-2. Далее, BgllI-XhoI-фрагмент плазмиды pGEM-desC-2 клонировали в вектор pET-22(b), предварительно гидролизованный ферментами BamHI и SalI, с образованием экспрессионного вектора pET-desC. Экспрессион-ный вектор pET-licBM3 получали клонированием фрагмента BamHI-SalI плазмиды pQE-licBM3 в плазмиду pET-22(b), предварительно гидролизованную ферментами BamHI и SalI. Вектор pET-desC-licBM3 был получен в несколько этапов. Первоначально фрагмент XhoI-SalI-плазмиды pGEM-licBM3-2 был клонирован в плазмиду pGEM-desC-2, предварительно гидролизованную ферментами XhoI и SalI, с образованием плазмиды pGEM-desC-2-licBM3. Далее, фрагмент BamHI-SalI плазмиды pGEM-desC-2-licBM3 был клонирован в вектор pET-22(b), предварительно гидролизованный ферментами BamHI и SalI, с образованием экспрессионного вектора pET-desC-licBM3. Корректность
клонирования нативного гена и сборки гибридного гена подтверждена секвенированием.
ИПТГ-индуцибелъную экспрессию генов в клетках E. coli осуществляли согласно протоколу фирмы "Invitrogen" (США). Клетки выращивали на жидкой LB-среде до ОП 0.5 при 600 нм, далее в среду добавляли ИПТГ до конечной концентрации 0.5 мМ.
Получение белковых экстрактов и определение активности лихеназы проводили по модифицированной нами методике [12].
Количество белка в препаратах определяли по методу Бредфорд [13], используя Bio-Rad Dye реагент ("BioRad", США) и БСА ("Sigma", США) для построения калибровочной кривой.
Электрофорез препаратов белков проводили по методу [14] в денатурирующих условиях в ПААГ.
Выделение жирных кислот и их определение методом газожидкостной хроматографии. Индукцию штаммов, несущих плазмиды pET-licBM3, pET-desQ pET-desС-licBM3, проводили при 37°С на минимальной среде с ампициллином (200 мкг/мл), витамином В1 (в конечной концентрации 0.5 мкг/мл) и FeCl3 (в конечной концентрации 10 мкМ). В качестве контроля использовали штамм, несущий плазмиду pET22. Стеарат натрия (С18:0, 1 мкМ) добавляли в среду в качестве субстрата для клеток, экспрессирующих нативный и гибридный ген desC. При ОП 0.4 при 600 нм добавляли ИПТГ до конечной концентрации 0.4 мМ, индукцию проводили в течение 4 ч. Затем клетки осаждали центрифугированием, осадок промывали физиологическим раствором. Метиловые эфиры Жк получали метанолизом, как описано ранее [15], и анализировали с помощью ГЖХ [16].
Анализ последовательности гена desC выполняли с использованием компьютерных программ: GENSCAN (http://genes.mit.edu/GENSCAN,html -поиск интронов, полиА-сигналов); Codon Usage Database - http://www.kazusa.or.jp/codon/; Countco-don program - http://www.k
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.