МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 3, с. 293-299
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.841.91:577.121.7(285.2)
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА АНАЭРОБНЫХ АЛКАЛОФИЛОВ ИЗ СОДОВЫХ ОЗЕР
© 2004 г. А. В. Питрюк, Е. Н. Деткова, М. А. Пушева
Институт микробиологии РАН, Москва Поступила в редакцию 12.08.02 г.; после доработки 10.07.03 г.
Изучено действие ингибиторов энергетического обмена и ионофоров на рост и образование продуктов метаболизма у алкалофильных анаэробов с различными типами катаболизма. Показано, что при блокировании окислительного фосфорилирования добавлением в среду ^№-дициклогек-силкарбодиимида (ДЦКД), ингибитора F^-АТФ-синтазы, рост клеток ацетогенной бактерии Tindallia magadiensis при использовании аргинина как акцептора электронов полностью подавлялся. При использовании пирувата имело место субстратное фосфорилирование. Метилотрофный мета-ноген Methanosalsus zhilinae не рос в присутствии ДЦКД и ванадата, ингибитора Е1Е2-АТФазы, что может свидетельствовать о наличии у него двух типов АТФаз. У сахаролитических алкалофилов Halonatronum saccharophilum, Amphibacillus tropicus и Spirohaeta alkalica, растущих при различных оп-тимумах рН, вклад Н+-градиента в энергетический обмен и, возможно, в поддержание внутриклеточного рН уменьшался с увеличением степени алкалофилии. На основании ингибиторного анализа с использованием протонофоров, моненсина и амилорида можно полагать что все исследованные бактерии зависят от Н+- и №+-градиентов и №+/И+-антипорт является, по-видимому, универсальным механизмом для регуляции внутриклеточного рН и взаимодействия Na+- и Н+-циклов при выращивании клеток в щелочных средах.
Ключевые слова: алкалофилы, анаэробы, гомоацетогены, метаногены, бродильщики, биоэнергетика, АТФазы.
Исследование экстремально галоалкалофиль-ных анаэробных прокариот представляет большой интерес с точки зрения биоэнергетических проблем, связанных с ростом организмов при рН более 9 [1]. Основной проблемой для экстремально алкалофильных бактерий является поддержание внутриклеточного рН и биоэнергетического статуса клетки в среде с низкой концентрацией протонов. На мембранах алкалофилов устанавливается обратного знака протонный градиент, и, следовательно, протон, транспортируемый из клетки в результате, например, дыхания, не может совершать полезную работу при возвращении обратно в клетку, так как будет двигаться против протонного градиента. Одним из возможных вариантов адаптации к росту в щелочных условиях является использование натриевого энергетического цикла. Были описаны процессы генерации и использования Ка+-градиента в мембранах морских щелочеустойчивых и умеренно галофильных вибрионов [2]. С другой стороны, Ка+-цикл был обнаружен также у некоторых нейтрофильных анаэробов, например, у ацетоге-нов и метаногенов [3].
Ингибиторный анализ роста и синтеза продуктов нейтрофильных, галофильных и алкалофильных прокариот позволяет, в определенной
степени, оценить вклад окислительного или субстратного фосфорилирования и значение Н+- и Ка+-градиентов для прокариотных бактерий с различными типами метаболизма.
Ранее нами было показано, что энергетический обмен экстремально алкалофильных анаэробов - ацетогенных бактерий Natroniella acetigena и Natronincola histidinovorans и сульфатредукто-ров из содовых озер зависит как от протонного, так и от натриевого электрохимических градиентов и основан на электрон-транспортном фосфо-рилировании, сопряженным с переносом электронов по хемиосмотическому механизму при участии мембранных АТФ-синтаз, независимо от используемого субстрата [4-6].
Из содовых озер были выделены также ацето-генный аммонификатор TmdaШa magadiensis (ранее T. magadii) [7], метилотрофный метаноген Methanosalsus zhttmae [8] и сахаролитические ана-эробы-бродильщики [9, 10].
T. magadiensis - алкалофильная, облигатно анаэробная, неспорообразующая бактерия, энергетический обмен которой основан на использовании ряда аминокислот и органических кислот. Рост бактерии облигатно зависит от Ка+ и является оптимальным при концентрации КаИС03 в среде 4-8%. В отличие от галоалкалофильных аце-
тогенов, бактерия не нуждается в NaCl для роста. Этот умеренно алкалофильный микроорганизм (оптимум роста при pH 8.5) представляет интерес с точки зрения натриевой энергетики. Метило-трофный метаноген M. zhilinae, растущий на метаноле при оптимуме рН 9.2, облигатно зависит
от добавления Na+ и HCO3.
Прокариотные сахаролитические бродильщи-ки в основном осуществляют брожение, при котором акцепторами восстановительных эквивалентов служат продукты расщепления субстрата. Энергетический обмен таких организмов основан на субстратном фосфорилировании. Для транспорта веществ, движения жгутиков и поддержания внутриклеточного рН необходимы ионные градиенты, которые в клетках бродильщиков образуются за счет гидролиза АТФ при участии ион-транспортирующих АТФаз [2]. Генерация ионного градиента за счет гидролиза АТФ при участии АТФазы возможна не только у бродильщиков; однако лишь у бродильщиков невозможна АТФ-синтазная функция этого фермента, вероятно, в связи с наличием другого механизма обеспечения энергии - субстратного фосфорили-рования [2, 11].
Целью настоящего исследования явилось изучение влияния ионофоров и ингибиторов на рост и образование основных продуктов у различных по метаболизму представителей алкалофильных анаэробных прокариот.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали чистые культуры анаэробных алкалофилов Tindallia magadiensis Z-793411, Methanosalsus zhilinae Z-793611, Spirohaeta alkalica Z-749F, Halonatronum saocharophilum Z-79861, и Amphibacillus tropicus Z-7792^ выделенные из оз. Магади (Кения) и предоставленные Т.Н. Жилиной и В.В. Кевбриным.
T. magadiensis культивировали в строго анаэробных условиях при 37°С, pH 8.5, на минеральной среде следующего состава (г/л): NaHCO3 - 40; KH2PO4 - 0.3; NH4Cl - 0.5; Na2S ■ 9H2O - 0.5; раствор микроэлементов (1 мл); 0.04% резазурин (2 мл); дрожжевой экстракт - 0.2 г/л. В качестве субстратов использовали аргинин (2 г/л) или пи-руват (5 г/л). Среду освобождали от кислорода кипячением с последующей продувкой аргоном в течение 15 мин. В охлажденную среду вносили NaHCO3, дрожжевой экстракт, резазурин как индикатор Eh среды, и восстановитель (Na2S). Затем среду разливали в токе аргона в пробирки Хан-гейта или во флаконы. Стерилизацию проводили в автоклаве в течение 30 мин при 120°С. Засев производили культурой, собранной в середине логарифмической фазы роста, из расчета 3% по объему [7].
M. zhilinae культивировали при pH 9.2 на среде с метанолом (0.5%) следующего состава (г/л): K2HP04 - 0.2; KCl - 0.2; NH4Cl - 1.0; NaHCO3 - 32.0; раствор микроэлементов - 1 мл; раствор витаминов - 2 мл; 0.04% резазурин - 2 мл; Na2S ■ 9H2O - 0.5 [7]. S. аlkalica выращивали при рН 9.0 анаэробно на среде, содержащей (г/л): Na2CO3 - 2.0; NaHCO3 -4.5; NaCl - 48.0; NH4Cl - 0.5; KH2PO4 - 0.2; дрожжевой экстракт - 0.5; сахароза - 5.0; раствор микроэлементов - 1мл; раствор витаминов - 1 мл; 0.04% резазурин - 2 мл [8]. Для культивирования A. tropicus и H. sa^harophilum использовали следующую среду (г/л): KH2PO4 - 0.2; MgCl2 - 0.1; NH4Cl - 0.5; KCl - 0.2; NaCl - 50.0; Na2CO3 - 68.0; NaHCO3 - 38.0; Na2S ■ 9H2O - 0.7; дрожжевой экстракт - 0.2; сахароза - 5.0; раствор микроэлементов - 1 мл; раствор витаминов - 1 мл; 0.04% резазурин - 2 мл, рН 9.7 [10].
Раствор микроэлементов (мг/л): MnCl2 ■ 4H2O -720; (NH4)2SO4 ■ 6H2O - 400; FeSO4 ■ 7H2O - 200; CoCl2 ■ 6H2O - 200; ZnSO4 ■ 7H2O - 200; NiCl2 ■ ■ 6H2O - 100; CuSO4 ■ 5H2O - 20; AlK(SO4)2 ■ 12H2O -20; H3BO4 - 20; Na2MoO4 ■ 4H2O - 20; ЭДТА - 1 г/л. Раствор витаминов (мг/л): 4-аминобензойная кислота - 25; D-биотин - 100; никотиновая кислота -25; пантетонат кальция - 25; пиридоксин гидрохлорид - 25; фолиевая кислота - 10; рибофлавин - 25; цианокобаламин - 0.5; липоевая килота - 25.
Рост бактерий определяли по оптической плотности при 600 нм на спектрофотометре Spe-kol-11 (Германия) непосредственно в пробирках или в 1-см кюветах, прямым подсчетом клеток или по количеству внутриклеточного белка после осаждения клеток центрифугированием при 14500 g в течение 3 мин и последующего их гидролиза в 1 N NaOH. Белок определяли по Лоури [12].
Для получения клеточных суспензий S. alkalica активно растущие клетки осаждали центрифугированием при 4550 g в течение 60 мин, отмывали и ресуспендировали в минеральной среде для культивирования, содержащей 3 мМ дитиотреи-тол, 2 мМ MgCl2 и 0.5% этанол. Конечное содержание клеточного белка в суспензиях составляло 0.6-1 мг/мл. Клеточные суспензии получали в анаэробных условиях.
Ацетат определяли на газовом хроматографе Chrom-5 (Чехия) с пламенно-ионизационным детектором. Разделение проводили при 160°С на стеклянной колонке 0.9 м х 3 мм, заполненной Chromosorb-101 ("Sigma", США), газ-носитель -аргон. Для определения ацетата культуральную жидкость подкисляли концентрированной HCl до рН 2, после чего 2 мкл образца вводили в колонку. Водород определяли на хроматографе ЛХМ-80 с катарометром, газ-носитель - аргон. Разделение проводили на колонке 0.75 м х 3 мм, заполненной молекулярным ситом 5А.
Ацетат, мМ
25 г
20 15 10
п
и
о
г
Белок, мг/мл i Ацетат -|0.Ш
□ Белок
_гт
0.02
1
и «
я
и
о
ЧО
и я
о Рч
я О. О И Я
S <
•е я
•е
0.01
Ацетат, мМ 35
30
25
20
15
10
и о О. Н Я
О «
■ Ацетат □ Белок
Белок, мг/мл 0.03
0.02
и «
я
и
о
ЧО
я я S
о Рч
я
!Х
О И Я
S <
Я
•е
0.01
Рис. 1. Влияние ингибиторов и ионофоров на выход биомассы и ацетогенез Т. magadiensis при росте на среде с аргинином (2 г/л) через 3 сут культивирования (начало стационарной фазы). ДЦКД - 500 мкМ; ванадат -50 мкМ; родамин 60 - 3 мкМ; 8Б-6847 - 3.2 мкМ; монен-син - 10 мкМ; амилорид - 50 мкМ; ФКЦФ - 50 мкМ.
Рис. 2. Влияние ингибиторов и ионофоров на выход биомассы и ацетогенез Т. magadiensis при росте на среде с пируватом (5 г/л) через 3 сут культивирования (начало стационарной фазы). Концентрации ингибиторов те же, что и при росте на среде с аргинином.
Активность гидрогеназы определяли по восстановлению бензилвиологена в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.