научная статья по теме СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА АНАЭРОБНЫХ АЛКАЛОФИЛОВ ИЗ СОДОВЫХ ОЗЕР Биология

Текст научной статьи на тему «СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА АНАЭРОБНЫХ АЛКАЛОФИЛОВ ИЗ СОДОВЫХ ОЗЕР»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 3, с. 293-299

= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 579.841.91:577.121.7(285.2)

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА АНАЭРОБНЫХ АЛКАЛОФИЛОВ ИЗ СОДОВЫХ ОЗЕР

© 2004 г. А. В. Питрюк, Е. Н. Деткова, М. А. Пушева

Институт микробиологии РАН, Москва Поступила в редакцию 12.08.02 г.; после доработки 10.07.03 г.

Изучено действие ингибиторов энергетического обмена и ионофоров на рост и образование продуктов метаболизма у алкалофильных анаэробов с различными типами катаболизма. Показано, что при блокировании окислительного фосфорилирования добавлением в среду ^№-дициклогек-силкарбодиимида (ДЦКД), ингибитора F^-АТФ-синтазы, рост клеток ацетогенной бактерии Tindallia magadiensis при использовании аргинина как акцептора электронов полностью подавлялся. При использовании пирувата имело место субстратное фосфорилирование. Метилотрофный мета-ноген Methanosalsus zhilinae не рос в присутствии ДЦКД и ванадата, ингибитора Е1Е2-АТФазы, что может свидетельствовать о наличии у него двух типов АТФаз. У сахаролитических алкалофилов Halonatronum saccharophilum, Amphibacillus tropicus и Spirohaeta alkalica, растущих при различных оп-тимумах рН, вклад Н+-градиента в энергетический обмен и, возможно, в поддержание внутриклеточного рН уменьшался с увеличением степени алкалофилии. На основании ингибиторного анализа с использованием протонофоров, моненсина и амилорида можно полагать что все исследованные бактерии зависят от Н+- и №+-градиентов и №+/И+-антипорт является, по-видимому, универсальным механизмом для регуляции внутриклеточного рН и взаимодействия Na+- и Н+-циклов при выращивании клеток в щелочных средах.

Ключевые слова: алкалофилы, анаэробы, гомоацетогены, метаногены, бродильщики, биоэнергетика, АТФазы.

Исследование экстремально галоалкалофиль-ных анаэробных прокариот представляет большой интерес с точки зрения биоэнергетических проблем, связанных с ростом организмов при рН более 9 [1]. Основной проблемой для экстремально алкалофильных бактерий является поддержание внутриклеточного рН и биоэнергетического статуса клетки в среде с низкой концентрацией протонов. На мембранах алкалофилов устанавливается обратного знака протонный градиент, и, следовательно, протон, транспортируемый из клетки в результате, например, дыхания, не может совершать полезную работу при возвращении обратно в клетку, так как будет двигаться против протонного градиента. Одним из возможных вариантов адаптации к росту в щелочных условиях является использование натриевого энергетического цикла. Были описаны процессы генерации и использования Ка+-градиента в мембранах морских щелочеустойчивых и умеренно галофильных вибрионов [2]. С другой стороны, Ка+-цикл был обнаружен также у некоторых нейтрофильных анаэробов, например, у ацетоге-нов и метаногенов [3].

Ингибиторный анализ роста и синтеза продуктов нейтрофильных, галофильных и алкалофильных прокариот позволяет, в определенной

степени, оценить вклад окислительного или субстратного фосфорилирования и значение Н+- и Ка+-градиентов для прокариотных бактерий с различными типами метаболизма.

Ранее нами было показано, что энергетический обмен экстремально алкалофильных анаэробов - ацетогенных бактерий Natroniella acetigena и Natronincola histidinovorans и сульфатредукто-ров из содовых озер зависит как от протонного, так и от натриевого электрохимических градиентов и основан на электрон-транспортном фосфо-рилировании, сопряженным с переносом электронов по хемиосмотическому механизму при участии мембранных АТФ-синтаз, независимо от используемого субстрата [4-6].

Из содовых озер были выделены также ацето-генный аммонификатор TmdaШa magadiensis (ранее T. magadii) [7], метилотрофный метаноген Methanosalsus zhttmae [8] и сахаролитические ана-эробы-бродильщики [9, 10].

T. magadiensis - алкалофильная, облигатно анаэробная, неспорообразующая бактерия, энергетический обмен которой основан на использовании ряда аминокислот и органических кислот. Рост бактерии облигатно зависит от Ка+ и является оптимальным при концентрации КаИС03 в среде 4-8%. В отличие от галоалкалофильных аце-

тогенов, бактерия не нуждается в NaCl для роста. Этот умеренно алкалофильный микроорганизм (оптимум роста при pH 8.5) представляет интерес с точки зрения натриевой энергетики. Метило-трофный метаноген M. zhilinae, растущий на метаноле при оптимуме рН 9.2, облигатно зависит

от добавления Na+ и HCO3.

Прокариотные сахаролитические бродильщи-ки в основном осуществляют брожение, при котором акцепторами восстановительных эквивалентов служат продукты расщепления субстрата. Энергетический обмен таких организмов основан на субстратном фосфорилировании. Для транспорта веществ, движения жгутиков и поддержания внутриклеточного рН необходимы ионные градиенты, которые в клетках бродильщиков образуются за счет гидролиза АТФ при участии ион-транспортирующих АТФаз [2]. Генерация ионного градиента за счет гидролиза АТФ при участии АТФазы возможна не только у бродильщиков; однако лишь у бродильщиков невозможна АТФ-синтазная функция этого фермента, вероятно, в связи с наличием другого механизма обеспечения энергии - субстратного фосфорили-рования [2, 11].

Целью настоящего исследования явилось изучение влияния ионофоров и ингибиторов на рост и образование основных продуктов у различных по метаболизму представителей алкалофильных анаэробных прокариот.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали чистые культуры анаэробных алкалофилов Tindallia magadiensis Z-793411, Methanosalsus zhilinae Z-793611, Spirohaeta alkalica Z-749F, Halonatronum saocharophilum Z-79861, и Amphibacillus tropicus Z-7792^ выделенные из оз. Магади (Кения) и предоставленные Т.Н. Жилиной и В.В. Кевбриным.

T. magadiensis культивировали в строго анаэробных условиях при 37°С, pH 8.5, на минеральной среде следующего состава (г/л): NaHCO3 - 40; KH2PO4 - 0.3; NH4Cl - 0.5; Na2S ■ 9H2O - 0.5; раствор микроэлементов (1 мл); 0.04% резазурин (2 мл); дрожжевой экстракт - 0.2 г/л. В качестве субстратов использовали аргинин (2 г/л) или пи-руват (5 г/л). Среду освобождали от кислорода кипячением с последующей продувкой аргоном в течение 15 мин. В охлажденную среду вносили NaHCO3, дрожжевой экстракт, резазурин как индикатор Eh среды, и восстановитель (Na2S). Затем среду разливали в токе аргона в пробирки Хан-гейта или во флаконы. Стерилизацию проводили в автоклаве в течение 30 мин при 120°С. Засев производили культурой, собранной в середине логарифмической фазы роста, из расчета 3% по объему [7].

M. zhilinae культивировали при pH 9.2 на среде с метанолом (0.5%) следующего состава (г/л): K2HP04 - 0.2; KCl - 0.2; NH4Cl - 1.0; NaHCO3 - 32.0; раствор микроэлементов - 1 мл; раствор витаминов - 2 мл; 0.04% резазурин - 2 мл; Na2S ■ 9H2O - 0.5 [7]. S. аlkalica выращивали при рН 9.0 анаэробно на среде, содержащей (г/л): Na2CO3 - 2.0; NaHCO3 -4.5; NaCl - 48.0; NH4Cl - 0.5; KH2PO4 - 0.2; дрожжевой экстракт - 0.5; сахароза - 5.0; раствор микроэлементов - 1мл; раствор витаминов - 1 мл; 0.04% резазурин - 2 мл [8]. Для культивирования A. tropicus и H. sa^harophilum использовали следующую среду (г/л): KH2PO4 - 0.2; MgCl2 - 0.1; NH4Cl - 0.5; KCl - 0.2; NaCl - 50.0; Na2CO3 - 68.0; NaHCO3 - 38.0; Na2S ■ 9H2O - 0.7; дрожжевой экстракт - 0.2; сахароза - 5.0; раствор микроэлементов - 1 мл; раствор витаминов - 1 мл; 0.04% резазурин - 2 мл, рН 9.7 [10].

Раствор микроэлементов (мг/л): MnCl2 ■ 4H2O -720; (NH4)2SO4 ■ 6H2O - 400; FeSO4 ■ 7H2O - 200; CoCl2 ■ 6H2O - 200; ZnSO4 ■ 7H2O - 200; NiCl2 ■ ■ 6H2O - 100; CuSO4 ■ 5H2O - 20; AlK(SO4)2 ■ 12H2O -20; H3BO4 - 20; Na2MoO4 ■ 4H2O - 20; ЭДТА - 1 г/л. Раствор витаминов (мг/л): 4-аминобензойная кислота - 25; D-биотин - 100; никотиновая кислота -25; пантетонат кальция - 25; пиридоксин гидрохлорид - 25; фолиевая кислота - 10; рибофлавин - 25; цианокобаламин - 0.5; липоевая килота - 25.

Рост бактерий определяли по оптической плотности при 600 нм на спектрофотометре Spe-kol-11 (Германия) непосредственно в пробирках или в 1-см кюветах, прямым подсчетом клеток или по количеству внутриклеточного белка после осаждения клеток центрифугированием при 14500 g в течение 3 мин и последующего их гидролиза в 1 N NaOH. Белок определяли по Лоури [12].

Для получения клеточных суспензий S. alkalica активно растущие клетки осаждали центрифугированием при 4550 g в течение 60 мин, отмывали и ресуспендировали в минеральной среде для культивирования, содержащей 3 мМ дитиотреи-тол, 2 мМ MgCl2 и 0.5% этанол. Конечное содержание клеточного белка в суспензиях составляло 0.6-1 мг/мл. Клеточные суспензии получали в анаэробных условиях.

Ацетат определяли на газовом хроматографе Chrom-5 (Чехия) с пламенно-ионизационным детектором. Разделение проводили при 160°С на стеклянной колонке 0.9 м х 3 мм, заполненной Chromosorb-101 ("Sigma", США), газ-носитель -аргон. Для определения ацетата культуральную жидкость подкисляли концентрированной HCl до рН 2, после чего 2 мкл образца вводили в колонку. Водород определяли на хроматографе ЛХМ-80 с катарометром, газ-носитель - аргон. Разделение проводили на колонке 0.75 м х 3 мм, заполненной молекулярным ситом 5А.

Ацетат, мМ

25 г

20 15 10

п

и

о

г

Белок, мг/мл i Ацетат -|0.Ш

□ Белок

_гт

0.02

1

и «

я

и

о

ЧО

и я

о Рч

я О. О И Я

S <

•е я

•е

0.01

Ацетат, мМ 35

30

25

20

15

10

и о О. Н Я

О «

■ Ацетат □ Белок

Белок, мг/мл 0.03

0.02

и «

я

и

о

ЧО

я я S

о Рч

я

О И Я

S <

Я

•е

0.01

Рис. 1. Влияние ингибиторов и ионофоров на выход биомассы и ацетогенез Т. magadiensis при росте на среде с аргинином (2 г/л) через 3 сут культивирования (начало стационарной фазы). ДЦКД - 500 мкМ; ванадат -50 мкМ; родамин 60 - 3 мкМ; 8Б-6847 - 3.2 мкМ; монен-син - 10 мкМ; амилорид - 50 мкМ; ФКЦФ - 50 мкМ.

Рис. 2. Влияние ингибиторов и ионофоров на выход биомассы и ацетогенез Т. magadiensis при росте на среде с пируватом (5 г/л) через 3 сут культивирования (начало стационарной фазы). Концентрации ингибиторов те же, что и при росте на среде с аргинином.

Активность гидрогеназы определяли по восстановлению бензилвиологена в

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком