БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 3, с. 402 - 407
УДК 577.112.6
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ХИМОЗИНА ТЕЛЕНКА И ЕГО РЕКОМБИНАНТНЫХ ФОРМ
© 2006 г. В.В. Старовойтова1, Т.И. Величко1, Л.А. Баратова2, И.Ю. Филиппова1*, Г.И. Лавренова1
1 Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119992 Москва; факс: (495)932-8846, электронная почта: irfilipp@genebee.msu.su
2 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119992 Москва; факс: (495)939-3181, электронная почта: baratova@belozersky.msu.ru
Поступила в редакцию 05.04.05
Изучено действие природного химозина теленка, химозина, выделенного из молока трансгенных овец, и химозина, экспрессированного в дрожжах Kluyveromyces lactis (препарат Maxiren), на флуорогенные пептидные субстраты: Abz-A-A-F-F-A-A-Ded, Abz-A-A-F-F-A-A-pNA, Abz-A-F-F-A-A-Ded, Abz-A-A-F-F-A-Ded, Abz-A-A-F-F-Ded, Abz-A-A-F-F-pNA и гептапептид L-S-F-M-A-I-P-NH2 — фрагмент природного субстрата химозина, к-казеина. Установлено, что трансгенный химозин и химозин Maxiren отличаются от природного фермента по действию на низкомолекулярные субстраты, в то время как различий в действии ферментов на белковые субстраты не наблюдается. Отмечено, что пепстатин, специфический ингибитор аспартат-ных протеиназ, ингибирует рекомбинантные формы химозина медленнее, чем природный фермент. Возможно, это связано с локальными конформационными изменениями в участках связывания субстрата в ре-комбинантных формах химозина, которые могут происходить в процессе формирования белковой глобулы.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: химозин, рекомбинантные химозины, флуорогенные субстраты, пепстатин.
Химозин — один из протеолитических ферментов, секретируемых слизистой оболочкой желудка новорожденных млекопитающих. Среди химозинов различных животных наиболее изучен химозин теленка. Установлены его первичная и пространственная структуры, обсуждается механизм действия. На долю химозина приходится ~80% общей протеолитической активности слизистой сычуга молочных телят. С возрастом его содержание убывает и доминирующим становится пепсин. В отличие от большинства других аспартатных протеиназ пищеварительного тракта фермент имеет узкую субстратную специфичность. В к-казеине молока он расщепляет преимущественно связь РИе105—Ме11106, что нарушает стабильность мицелл казеина и приводит к образованию творожистого осадка. При высокой молокоствораживающей активности общая про-теолитическая активность химозина невелика. Эта особенность поведения фермента создала
Принятые сокращения: Abz — о-аминобензоил, Ded и рМА — остатки 2,4-динитрофенилэтилендиамина и п-нитроанилина соответственно.
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
предпосылки для широкого использования его в пищевой и медицинской промышленности. Обычно фермент выделяют из сычугов молочных телят. В последние годы в связи с недостатком сырья для получения сычужного фермента ведется поиск альтернативных источников химозина. Один из путей решения этой проблемы — использование рекомбинантных форм фермента. В качестве продуцентов химозина предложили использовать также трансгенных животных [1]. Получение химозина в молоке трансгенных животных привлекательно еще и потому, что необязательно выделять белок в чистом виде для его дальнейшего применения в пищевой промышленности, поскольку он находится в естественном пищевом продукте — молоке.
Как правило, рекомбинантные формы химозина характеризовали только наличием активности по створаживанию молока и взаимодействием с антителами. Физико-химические и ферментативные свойства при этом тщательно не изучались. Однако внедрение в промышленность рекомбинантных ферментов в качестве заменителей сычужного химозина требует детального исследования их свойств.
Ранее нами был описан метод выделения мо-локоствораживающего фермента из молока трансгенных овец [1]. Было показано, что по целому ряду параметров: аминокислотному составу, молекулярной массе, аминоконцевой последовательности, характеристикам гидролиза белковых субстратов, устойчивости при различных значениях рН — выделенный фермент идентичен химозину теленка.
Цель данной работы — дальнейшее исследование функциональных свойств рекомбинант-ных форм химозина (химозина из молока трансгенных овец (трансгенного химозина), а также химозина, экспрессированного в дрожжах Шыуугготусгз \actis (химозина Мах1геп)) и сравнение их со свойствами природного фермента. При этом основное внимание мы уделили изучению взаимодействия ферментов с низкомолекулярными пептидными субстратами и специфическим ингибитором аспартатных протеиназ — пепстатином.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Химозин теленка выделяли из промышленного препарата сычужного фермента [2]. Химозин из молока трансгенных овец выделяли, как описано в [1].
Выделение рекомбинантного химозина из препарата Maxiren. 1 г препарата Maxiren («Gist-brocades», Нидерланды) перемешивали 2 ч при комнатной температуре в 5 мл 0,1 М натрий-ацетатного буфера, pH 5,4. Полученную суспензию диализовали против 0,1 М натрий-ацетатного буфера, pH 5,4, и центрифугировали (15 000 g, 4°, 30 мин). Супернатант (9,5 мл) наносили на колонку с 5 мл бацитрацин-сефарозы (содержание лиганда 6,8 мкмоль/мл [3]), уравновешенную 0,1 М натрий-ацетатным буфером, pH 5,4. Колонку промывали 0,1 М натрий-ацетатным буфером, рН 5,4, и 1 М NaCl в 0,1 М натрий-ацетатном буфере, рН 5,4, до ^280 < 0,1 в элюате. Фермент элюировали 10%-ным раствором изопропилового спирта в 1 М NaCl в 0,1 М натрий-ацетатном буфере, рН 5,4. Фракцию, содержавшую химозин, обессоливали на сефадексе G-50 (грубом), уравновешенном водой, и лио-филизовали. Выход фермента составил ~2 мг. Выход по активности, определенной по створаживанию молока [2], составил 99%.
Зависимость устойчивости ферментов от рН определяли методом, описанным Мезиной и др. [1].
Определение зависимости активности ферментов от температуры. Раствор фермента концентрацией 50 мкг/мл в 0,1 М натрий-ацетатном буфере, рН 5,6, инкубировали 15 мин при 28, 37, 40,
50 и 60°. После этого определяли молокоствора-живающую активность фермента при 37° [2].
Аминокислотный анализ выполняли на автомагическом анализаторе аминокислот Hitachi-835 («Hitachi», Япония) после гидролиза белка (48 ч) или пептида (24 ч) 5,7 М HCl при 105°.
Гидролиз флуорогенных пептидных субстратов. В работе использовали пептидные флуоро-генные субстраты с внутренним тушением флуоресценции, синтезированные ранее в нашей лаборатории [4]:
Abz-A-A-F-F-A-A-Ded (I),
Abz-A-A-F-F-A-A-pNA (II),
Abz-A-F-F-A-A-Ded (III),
Abz-A-A-F-F-A-Ded (IV),
Abz-A-A-F-F-Ded (V),
Abz-A-A-F-F-pNA (VI).
Начальные скорости гидролиза субстратов (V)), кинетические характеристики и влияние рН на V0 определяли, как описано в работе [2]. Время гидролиза, за которое происходило изменение флуоресценции, соответствующее 10-20%-ному гидролизу субстрата, составило 2—3 мин. Концентрация трансгенного химозина и химозина Maxiren составляла 14 нМ для всех субстратов.
Гидролиз субстрата L-S-F-M-A-I-P-NH2. Амид гептапептида был любезно предоставлен Л.Д. Румшем (ИБХ РАН).
К 50 мкл 1 мМ раствора субстрата в 0,05 М натрий-ацетатном буфере, pH 4,7, добавляли 50 мкл 0,05 М натрий-ацетатного буфера, pH 4,7, и 5 мкл 0,4 мкМ раствора фермента в 0,05 М натрий-ацетатном буфере, pH 5,0. Через 5,10,20,30 мин реакцию останавливали добавлением к 10 мкл реакционной смеси 1,5 мкл 7%-ного раствора NaOH. Продукты гидролиза анализировали методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Altex Model 110A (США) на колонке С8 (4 х 250 мм). Элюцию проводили в линейном градиенте ацетонитрила в воде от 0 до 60%. Скорость элюции 0,8 мл/мин, время элюции 30 мин. Продукты гидролиза субстрата химозином теленка гидролизовали 5,7 М HCl при 105° в течение 24 ч. Затем определяли их аминокислотный состав.
Ингибирование пепстатином. Готовили раствор пепстатина с концентрацией 3 мг/мл в метиловом спирте. Из этого раствора разбавлением 0,1 М натрий-ацетатным буфером, рН 5,6, получали растворы пепстатина (концентрации 0,006
и 0,06 мг/мл). К 25 мкг (0,7 нмоль) фермента в 0,1 М натрий-ацетатном буфере, рН 5,6, добавляли такое количество растворов пепстатина (концентрации 6 и 60 мкг/мл), чтобы концентрации ингибитора в реакционной смеси, общий объем которой 1 мл, составляли 0,05, 0,075, 0,15, 0,25, 0,5, 1,0 мкг/мл или 0,07, 0,11, 0,22, 0,35, 0,7, 1,4 нмоль/мл соответственно. Смесь инкубировали при 37° в течение 30 мин. Затем отбирали 50 мкл для определения ферментативной активности по расщеплению флуорогенного субстрата Abz-A-A-F-F-A-A-Ded [2].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Химозин Maxiren получают в дрожжах K. lactis, клетки которых трансформируют кДНК химозина [5]. Дрожжи K. lactis имеют ряд преимуществ по сравнению с другими видами дрожжей. Они не патогенны для человека, что позволяет использовать экспрессированный в них химозин в пищевой промышленности. Дрожжи K. lactis обладают эффективной синтетической и секреторной способностью гетерологичных белков. Стабильность экспрессирующей системы в дрожжах K. lactis позволяет получать внеклеточный прохимозин в больших количествах, что способствует разработке крупномасштабного производства химозина. Полученный препарат был назван «Maxiren» и в настоящее время рекомендован к применению в качестве заменителя сычужного фермента.
Для очистки рекомбинантного химозина Maxiren от сопутствующих белков мы применили аффинную хроматографию на бацитрацин-сефарозе. Результаты очистки показали, что препарат содержит значительное количество балластных белков. Фракция, содержавшая активный фермент, составила лишь 5% общего количества белка, нанесенного на колонку. Удельная активность химозина по створаживанию молока возросла в 20 раз. По результатам диск-электрофореза в ПААГ в неденатурирующих условиях [6] рекомбинантный химозин Maxiren, полученный после аффинной хроматографии, гомогенен и, по-видимому, соответствует В-форме химозина теленка. Аминокислотный состав выделенного химозина Maxiren соответствует составу химозина теленка. Согласно нашим данным, химозин Maxiren имеет такие же оптимум рН и удельную активность расщ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.