МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 6, с. 849-850
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 579.841.31.083.3
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЛЕКТИНОВ АХ08Р1ШЬЬиМ БЕА81ЬЕ№Е 8р7 И ЕГО МУТАНТА НА АКТИВНОСТЬ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ
© 2004 г. С. А. Аленькина, О. А. Паюсова, В. Е. Никитина
Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов
Поступила в редакцию 26.02.04 г.
В ранних исследованиях на поверхности почвенных ассоциативных азотфиксирующих бактерий Azospirillum ЬгалИете 8р7 обнаружен, а затем выделен гликопротеин - лектин, проявляющий специфичность к ¿-фукозе (1.87 мМ) и к О-галак-тозе (20 мМ) [1]. Наиболее результативным способом изучения функций отдельных структур бактериальной поверхности является использование мутантов, дефектных по синтезу интересующего компонента. Нам не удалось получить бактериальные клетки, не продуцирующие лектин. Был получен штамм, клетки которого потеряли способность агрегировать эритроциты и утратили способность к взаимодействию с лектинспеци-фичными антителами, но имели на поверхности молекулы с идентичными лектину родительских клеток молекулярной массой и углеводной специфичностью [2].
Выявление функциональной роли лектинов почвенных бактерий при образовании азотфиксирующих систем в прикорневой зоне растений важно для дальнейшего познания молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействий "бактерии-растение". Ранее нами было показано, что лектины азоспирилл выполняют роль адгези-нов, обеспечивая специфическое прикрепление бактериальных клеток к корням пшеницы [3]. Относительно иных функций лектинов азоспирилл сведения полностью отсутствуют. В связи с этим целью настоящего исследования явилось выяснение способности лектинов азоспирилл влиять на некоторые гидролитические ферменты растительных клеток.
Исследовали почвенные ассоциативные азот-фиксирующие бактерии А. Ьга^йете 8р7, полученные из Института микробиологии РАН (Москва), а также штамм А. Ъга8Иете 8р7.2.3 с элиминированной лектиновой активностью, полученный транспозоновым мутагенезом из типового штамма А. Ъга8Иете 8р7 [2]. Лектины выделяли с бактериальной поверхности клеток по методу, описанному ранее [4]. Из корней 4-суточных проростков пшеницы сорта Саратовская 29, выращенных в асептических условиях из поверхностно-стерили-
зованных зерновок, были получены три фракции [3, 5]. Фракции инкубировали с раствором лекти-на определенной концентрации (оптимальная концентрация лектина и время инкубации подбирались экспериментальным путем). Затем активности а-, Р-глюкозидаз и Р-галактозидазы определяли по количеству нитрофенола, образовавшегося из субстрата 4-нитрофенил-а-О-глюкопиранозида, 4-нитрофенил-Р-О-глюкопиранозида и 4-нитрофе-нил-Р-О-галактопиранозида соответственно [6]. Количество образовавшегося нитрофенола определяли спектрофотометрически при X = 425 нм. За единицу активности фермента принимали то его количество, которое превращало 1 нМ субстрата за 1 мин. Удельную активность ферментов выражали, относя количество единиц активности ферментов к количеству мг белка. Экспериментальные данные обрабатывали статистически с использованием критерия Стьюдента [7].
Было показано, что инкубация лектина А. Ъrasilense 8р7 в концентрации 40 мкг/мл с тремя фракциями проростков пшеницы - фракцией экзокомпонентов, мембранной фракцией и фракцией апопластов, в течение 1 ч приводила к возрастанию активности растительных ферментов по сравнению с контролем, в качестве которого были взяты фракции корней проростков пшеницы, не инкубированные с лектином (таблица). Лектин мутантного штамма в той же концентрации проявлял аналогичный эффект, но в значительно меньшей степени. Наибольшее повышение всех ферментативных активностей для лектинов обоих штаммов наблюдалось во фракции экзокомпонентов. Обработка лектинов как родительского, так и мутантного штаммов специфическими гап-тенами (¿-фукозой и О-галактозой) перед инкубированием с фракциями корней продемонстрировало уменьшение эффекта, оказываемого лек-тинами на ферментативные активности для всех вариантов, но полного ингибирования не было ни в одном случае. Необходимо отметить, что оба гаптена одинаковым образом ингибировали эффект во всех вариантах для обоих штаммов, за исключением случая с лектином мутантного штамма и фракцией экзокомпонентов. В данном варианте
850 АЛЕНЬКИНА и др.
Влияние лектииов А. ЬгазИете Бр7 и его мутанта на активность гидролитических ферментов корней проростков пшеницы
Фракции корней проростков пшеницы, вариант опыта A. brasilense Sp7 A. brasilense Sp7.2.3
а-глюкозида-за, ед/мг Р-глюкозида-за, ед/мг Р-галактозида-за, ед/мг а-глюкозида-за, ед/мг Р-глюкозида-за, ед/мг Р-галактозида-за, ед/мг
Фэ 4.0 ± 0.2 2.2 ± 0.2 2.0 ± 0.5 4.0 ± 0.2 2.2 ± 0.2 2.0 ± 0.5
Фэ + Л 50.0 ± 0.8 57.0 ± 0.8 51.4 ± 1.2 32.5 ± 1.2 29.0 ± 1.1 22.0 ± 2.5
Фэ + (Л + Ф) 5.3 ± 0.1 4.0 ± 0.1 10.2 ± 0.4 20.0 ± 1.4 17.0 ± 0.9 6.0 ± 1.0
Фэ + (Л + Г) 4.9 ± 0.2 4.1 ± 0.2 12.0 ± 0.2 12.0 ± 0.5 2.0 ± 0.4 2.4 ± 0.4
Фм 14.5 ± 1.4 6.2 ± 0.1 6.0 ± 0.6 14.5 ± 1.4 6.2 ± 0.1 6.0 ± 0.6
Фм + Л 47.0 ± 1.2 74 ± 2.5 42.7 ± 2.7 20.0 ± 1.2 20.0 ± 0.5 16.0 ± 1.6
Фм + (Л + Ф) 19.3 ± 1.0 21.0 ± 0.3 30.0 ± 1.2 17.5 ± 0.4 19.5 ± 0.8 12.2 ± 0.4
Фм + (Л + Г) 18.0 ± 0.2 21.0 ± 2.1 25.0 ± 1.4 19.0 ± 1.7 20.0 ± 1.6 11.9 ± 2.5
Фа 29.2 ± 1.7 2.0 ± 0.2 4.0 ± 0.2 29.2 ± 1.7 2.0 ± 0.2 4.0 ± 0.2
Фа + Л 60.4 ± 0.9 31.9 ± 1.1 24.0 ± 1.8 39.8 ± 0.7 19.0 ± 1.4 13.0 ± 1.2
Фа + (Л + Ф) 32.0 ± 1.2 12.0 ± 0.5 6.0 ± 0.4 28.3 ± 1.2 16.5 ± 1.4 12.5 ± 0.5
Фа + (Л + Г) 29.3 ± 0.8 10.0 ± 0.4 4.9 ± 0.2 29.0 ± 0.5 17.0 ± 0.5 12.0 ± 0.5
Примечание. Фэ - фракция экзокомпонентов; Фм - мембранная фракция; Фа - фракция апопластов; Ф + Л - фракции, инкубированные с лектином; Ф + (Л + Ф) - фракции, инкубированные с лектином, предобработанным Ь-фукозой; Ф + (Л + Г) - фракции, инкубированные с лектином, предобработанным О-галактозой.
было отмечено различие в степени ингибирования эффекта ¿-фукозой и О-галактозой. Предварительное инкубирование лектина с О-галактозой приводило к более значительному снижению стимулирующей активности лектина. Для фракции экзокомпонентов специфичность была более выражена при взаимодействии лектина А. ЬгаэИепэе Sp7 с а-, Р-глюкозидазами и лектина А. Ьrasilense Sp7.2.3 с Р-галактозидазой. Для мембранной фракции и фракции апопластов не было отмечено отличий во взаимодействии лектинов обоих штаммов с а-, Р-глюкозидазами, но наблюдались отличия во взаимодействии лектинов с Р-галактозидазой. Так, взаимодействие лектина мутантного штамма с Р-галактозидазой мембранной фракции отличалось большей специфичностью по сравнению c лектином родительского штамма. Для фракции апопластов наблюдалась обратная картина - специфичность имела большее значение в случае с лектином родительского штамма. Обнаруженные различия во взаимодействии лектинов с ферментами изучаемых растительных фракций могут свидетельствовать о различии механизмов данных взаимодействий.
Работа выполнена при частичной поддержке гранта Президента РФ в поддержку молодых российских ученых и ведущих научных школ на выполнение научных исследований № НШ-1529.2003.4.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Итальянская Ю.В, Никитина В.Е., Пономарева Е.Г., Аленькина С.А. Лектины бактерий рода Azospirillum // Ученые записки Тарт. yH-та. 1989. Т. 35. С. 179.
2. Аленькина С.А, Петрова Л.П, Никитина В.Е. Получение и характеристика мутанта Azospirillum brasilense Sp7 по лектиновой активности // Микробиология. 1998. Т. 67. № 6. С. 782-787.
3. Никитина В.Е., Аленькина С.А, Пономарева Е.Г., Савенкова Н.Н. Изучение роли клеточной поверхности азоспирилл во взаимодействии с корнями пшеницы // Микробиология. 1996. Т. 65. № 2. С. 165-170.
4. Echdat Y, Ofek I, Yachow-Yan Y, Sharon N., Mire-lman D. Isolation of mannose-specific lectin from E. coli and its role in the adherence of the bacterial to epithelial cells // Biochem. Biophis. Res. Commun. 1978. V. 85. P. 1551-1559.
5. Rohringer R., Ebrahim-Nesbat F., Wolf G. Protein in intercellular washing fluid from leaves of Barley (Hor-deum vulgare) // J. Exp. Bot. 1983. V. 34. P. 1589-1605.
6. Carbohydrate analysis / Ed. Chaplin M.E., Kennedy J.E. Oxford: IRL Press, 1986. 228 p.
7. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск, 1973. 319 с.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.