БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 10, с. 1360 - 1370
УДК 577.152.1
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ПОЛИОЛОВ, СОЛЕЙ И СПИРТОВ НА КОНФОРМАЦИОННОЕ СОСТОЯНИЕ ЦИТОХРОМА с, СТИМУЛИРОВАННОЕ ТРИХЛОРУКСУСНОЙ КИСЛОТОЙ*
© 2006 г. А. Наим, М.Т. Ашраф, М. Акрам, Р.Х. Хан**
Interdisciplinary Biotechnology Unit and Department of Biochemistry, Aligarh Muslim University, Aligarh 202002, India; fax: (91-571)272-1776, E-mail: rizwanhkhan@hotmail.com, rizwanhkhan1@yahoo.com
Поступила в редакцию 23.01.2006 После доработки 18.04.2006
С помощью различных спектроскопических методов проведено систематическое изучение влияния поли-этиленгликолей, солей и спиртов на конформационное состояние феррицитохрома c, стимулированное трихлоруксусной кислотой (ТХУ). В спектре флуоресценции нативного цитохрома c имеется максимум при 335 нм, в то время как у ТХУ-стимулированной конформации цитохрома c этот максимум сдвинут на 7 нм в длинноволновую область, и интенсивность его возрастает. Спектры КД в ближней и дальней УФ-областях показывают, что третичная и вторичная структура белка в значительной степени утрачены, хотя по сравнению с конформацией при pH 2,0 белок относительно мало раскручен. Добавление 70% (по объему) растворов полиолов к цитохрому c с ТХУ (3,3 мМ)-стимулированной конформацией приводит к увеличению связывания 1-анилино-8-нафталинсульфоната (АНС) и росту средней эллиптичности аминокислотных остатков (СЭО) при 222 нм, что указывает на большую компактность при увеличении экспозиции гидрофобной поверхности. Стабилизирующее влияние солей и спиртов на ТХУ-стимулированную конформацию цитохрома c также изучено и сопоставлено с их влиянием на конформацию цитохрома c, раскрученного под действием трифторуксусной кислоты (ТФУ). По результатам вышеперечисленных методов, среди исследованных полиолов, солей и спиртов, наибольшее влияние на вторичную структуру ТХУ-стимулированной конформации цитохрома c оказывали ПЭГ-400, K3[Fe(CN)6] и бутанол. Что касается солей, то их эффект на вторичную структуру белка уменьшается в ряду K3[Fe(CN)6] > KClO4 > K2SO4 > KCl. Для спиртов аналогичный ряд выглядел следующим образом: бутанол > пропанол > этанол > метанол.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: спиртстимулированная конформация, анионстимулированная конформация, ци-тохром c, круговой дихроизм, флуоресценция, полиэтиленгликоль.
Цитохром с — небольшой глобулярный белок (104 аминокислотных остатка, молекулярная масса 12 700), содержащий значительную долю основных остатков. Он широко использовался в исследованиях кинетики и равновесия как модель укладки белка. Финк и др. отнесли цитохром с к белкам I типа из-за его раскручивания под действием кислоты [1—7]. При рН 2,2 и небольшой ионной силе раствора феррици-тохром с в значительной степени раскручен; при добавлении солей белок кооперативно укладывается в компактную структуру — состояние А, которое стабилизировано за счет связывания анионов с положительно заряженными группа-
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 05-227, 16.07.2006.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
ми на поверхности белка [8, 9]. Состояние А имеет структуру а-спирали, сравнимую со структурой нативного белка, но с меняющейся третичной структурой [10, 11]. В частности, гидрофобное ядро, содержащее две основных спирали и гем, стабилизированный невалентными взаимодействиями, сохраняется в состоянии А, в то время как структура петель меняется и частично разупорядочена. Случается, что из двух нативных аксиальных лигандов атома железа в геме только №818 остается координированным атомом железа в состоянии А, в то время как аксиальная связь с Ме180 утрачивается [12—14]. Гото и др. [14] показали, что основным фактором, стабилизирующим состояние А, является плотность заряда анионов; чем больше заряд, тем меньше концентрация ионов, необходимая для формирования расплавленной глобулы. Сан-туччи и др. [15] предположили, что небольшие
анионы стимулируют формирование компактного, высокоструктурированного состояния, в котором нативная аксиальная связь Met80-Fe(III) восстановлена и сохранены нативные окислительно-восстановительные свойства.
В нативном цитохроме с из сердца лошади связи между гемом и четырьмя аминокислотными остатками (Сув14, Cys17, His18 и Met80) фиксируют гем и наряду с разветвленной сетью невалентных контактов боковых цепей, эти связи делают внутреннюю структуру вокруг гема относительно жесткой. Аминокислотные остатки, имеющие Ван-дер-Ваальсовы контакты с гемом, — объемные гидрофобные группы, стабилизирующие структуру и контролирующие окислительно-восстановительный потенциал [16—21].
Ранее мы сообщали о влиянии солей и спиртов на а-химотрипсиноген и о существовании расплавленных глобулярных состояний при низких pH у бромелайна и конканавалина А [22—25]. В нашей лаборатории изучалось влияние Ds-Na и бутанола при различных pH и влияние солей и спиртов на цитохром c, обработанный ТФУ [26, 27]. В настоящей работе исследован эффект полиэтиленгликолей (ПЭГ-200 и ПЭГ-400) на стимулированное ТХУ состояние цитохрома с. Из-за присутствия атомов фтора ТФУ является более сильным денатурирующим агентом, чем ТХУ. Было также предпринято сравнительное изучение влияния солей и спиртов на ТХУ- и ТФУ-стимулированные состояния цитохрома c.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Реактивы. В настоящей работе использованы цитохром c из сердца лошади (тип III) фирмы «Sigma» (США), а соли и спирты фирмы «Qualigens» (Индия). Все использованные реактивы были марки ч.д.а.
Методы. Для исследования влияния полио-лов, солей и спиртов на ТХУ-стимулированное состояние цитохрома c, последний инкубировали в течение часа при комнатной температуре в присутствии полиолов, солей и спиртов в различных концентрациях.
Объемный анализ. Концентрацию ТХУ определяли титрованием 0,1 М Na2CO3, используя метиловый оранжевый в качестве индикатора. Определенная таким образом конечная концентрация составила 33 мМ; затем этот раствор использовали для приготовления 3,3 мМ ТХУ для раскручивания цитохрома с [28].
Спектры поглощения Cope. Для контроля оптического поглощения Cope гем-группы при 410 нм был использован однолучевой спектрофотометр
Hitachi U-1500 с кюветами толщиной 1 см. Концентрацию нативного цитохрома c определяли по коэффициенту поглощения 106,000 M—1 = см-1 при 410 нм.
Спектры кругового дихроизма. Для измерения кругового дихроизма был использован спектро-поляриметр JASCO J-720, калиброванный с помощью D-камфаро-Ю-сульфоната аммония. Концентрация белка для спектров КД в дальней и ближней УФ области составила 26 и 50 мкМ соответственно. Результаты были представлены в виде средней эллиптичности аминокислотных остатков (СЭО), которую рассчитывали по следующей формуле: СЭО = 9набл/(10HnHCpHl) [мград/М = см], где 9набл — наблюдаемая эллиптичность в мград, n - число аминокислотных остатков, Cp — молярная концентрация цитохрома с, а l — длина оптического пути в см.
Qj^ определяется как концентрация добавки (соли, полиола или спирта) в средней точке перехода, когда половина структуры цитохрома с изменяется под действием этой добавки. Величины C^ для солей и спиртов рассчитывали из значений СЭО при фиксированной длине волны. Значения получены для структурных переходов, стимулированных солями и спиртами соответственно.
Содержание а-спиральной структуры в цитохроме с рассчитывали из значения СЭО при 222 нм, используя формулу, предложенную Че-ном и др. [29]:
% а-спирали = (СЭО222 — 2340)/30300H100. (1)
Собственная флуоресценция. Спектры флуоресценции регистрировали с помощью спект-рофлуориметра Shimadzu RF-540 с кварцевыми кюветами толщиной 1 см. Образцы, содержавшие различные концентрации полиолов, солей и спиртов, инкубировали в течение часа при комнатной температуре перед регистрацией спектров флуоресценции триптофана. Длина волны возбуждения — 280 нм. Спектры испускания регистрировали при длинах волн от 300 до 400 нм. Конечная концентрация белка составила 15 мкМ. Каждый образец сравнивали с соответствующим ему контрольным образцом.
Спектры внешней (АНС) флуоресценции. Концентрацию исходного раствора 1-анилино-8-нафталинсульфоната (АНС) в дистиллированной воде определяли, принимая коэффициент поглощения при 350 нм равным 5000 М—1 = см—1. Молярное соотношение белок : АНС было 1 : 50. Длина волны возбуждения 380 нм, а спектры испускания регистрировали при длинах волн от 400 до 600 нм. Ширина щели при возбуждении и испускании составляла 10 пм. Конечная концент-
рация белка составляла 15 мкМ. Следует отметить, что АНС связывается органическими растворителями, поэтому во избежание ошибок для каждой точки делали контрольный опыт.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для выяснения влияния ТХУ на вторичную структуру цитохрома с, белок был оттитрован ТХУ. На рис. 1, а показаны спектры КД в дальней УФ области нативного белка (кривая 4), цитохрома с при рН 2,0 (кривая 1), белка в 3,3 мМ ТХУ (кривая 3) и в 33 мМ ТХУ (кривая 2). Оказалось, что при концентрации ТХУ 3,3 мМ вторичная структура цитохрома с в основном сохраняется, белок существует в относительно компактном виде по сравнению с состояниями, достигаемыми в 33 мМ ТХУ (кривая 2) и при рН 2,0 (кривая 1) соответственно (рис. 1, а). Спектры КД в ближней УФ области (рис. 1, б) показывают, что в 3,3 мМ ТХУ (кривая 3) происходит разрушение третичной структуры по сравнению с нативным белком (кривая 4). Белок меньше раскручен по сравнению с состоянием, достигаемым в 33 мМ ТХУ (кривая 2) и при рН 2,0 (кривая 1). Таким образом, можно сделать вывод, что в 3,3 мМ ТХУ цитохром с существует в частично уложенном состоянии с потерей третичной структуры. Однако, не исключено наличие взаимодействий, характерных для третичной структуры.
В цитохроме с резонансная энергия возбуждения триптофана передается гему, что приводит к тушению флуоресценции с А,макс = 335 нм (рис. 2, а, кривая 1). У конформации, стимулированной 3,3 мМ ТХУ, наблюдается сдвиг этого максимума на 7 нм в длинноволновую область и увеличение интенсивности флуоресценции (кривая 2). При рН 2,0 наблюдалось дальнейшее увеличение интенсивно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.