МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 76, № 5, с. 615-626
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.81.013:577.115
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЖИРНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА НЕКОТОРЫХ ГРУПП НЕСЕРНЫХ ПУРПУРНЫХ БАКТЕРИЙ
© 2007 г. Е. И. Компанцева*'1, И. Ф. Имхофф**, Б. Тиманн**, Е. Е. Пантелеева*,
В. Н. Акимов***
*Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва **Институт морских исследований им. Лейбница, Киль, Германия *** Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.Н. Скрябина РАН, Пущино
Поступила в редакцию 17.07.2006 г.
Методом капиллярной газовой хроматографии исследовали жирнокислотный состав (ЖКС) 43 штаммов несерных пурпурных бактерий, относящихся к 6 родам: Rubrivivax, Rhodopseudomonas, Rhodoplanes, Blastochloris, Rhodobium, Rhodomicrobium. Тестовые культуры выращивали на стандартной среде и в одинаковых условиях. Автоматическая идентификация метиловых эфиров жирных кислот, статистическая обработка результатов количественного анализа жирных кислот осуществлялись компьютеризированной системой Microbial Identification System (M.I.S.). Выявлены значимые различия ЖКС разных родов, видов, а иногда и штаммов несерных пурпурных бактерий. Проведено секвенирование 16S рРНК некоторых новых изолятов, в первую очередь, обладающих особым ЖКС. Определен таксономический статус ряда исследуемых штаммов с использованием в качестве одного из критериев характеристики ЖКС. Показано, что характеристика ЖКС может быть использована как для определения принадлежности выделенных штаммов к тому или иному виду, так и для выявления новых таксонов.
Ключевые слова: аноксифотобактерии, несерные пурпурные бактерии, жирные кислоты, евклидово расстояние, таксономия.
Уже более 30 лет жирнокислотный состав (ЖКС) наряду с составом полярных липидов и хино-нов успешно служит одним из критериев при таксономическом описании и идентификации микроорганизмов [1]. Это связано с тем, что ЖКС бактерий разных таксономических групп значительно различается как по соотношению основных жирных кислот (ЖК), так и по наличию характерных минорных компонентов. Исследования, посвященные изучению ЖКС аноксифотобактерий, показали, что для большинства из них характерно наличие не-разветвленных ЖК с четным числом атомов углерода, насыщенных или с одной двойной связью, с небольшим количеством оксикислот. При этом ЖКС таксонов разного ранга вплоть до видов может существенно различаться. Так, сравнительное изучение ЖКС представителей сем. Ectothiorho-dospiraceae [2] послужило одним из оснований для пересмотра их классификации. Показана возможность идентификации новых изолятов сем. Rhodo-bacteraceae на основании их ЖКС и состава полярных липидов [3]. Сравнительный анализ ЖКС большого числа видов и штаммов несерных пурпурных бактерий, проведенный японскими исследователя-
1 Автор для корреспонденции (e-mail : elenamaxi@mail.ru).
ми [4, 5], также выявил различия в их ЖКС на родовом и видовом уровнях.
ЖКС конкретного бактериального штамма может варьировать в значительных пределах. Входя, в основном, в состав мембран, ЖК образуют гидрофобную часть липидного бислоя. Изменения ЖКС являются одним из механизмов адаптации, выработанным в процессе эволюции и направленным на поддержание функциональной целостности мембран в разных условиях среды.
Вариации ЖКС отмечались даже в повторных посевах одного штамма фототрофных бактерий при одинаковых условиях культивирования. Наиболее изменчивым было содержание ЖК С18:1 (до 5%), концентрации других ЖК варьировали намного меньше [3]. По данным японских исследователей [4, 5], переход с фототрофного способа питания на хемотрофный вызывал незначительные изменения ЖКС несерных пурпурных бактерий. Однако по данным других авторов у некоторых видов, выращенных хемотрофно, снижалось содержание насыщенных ЖК [6]. Отмечены также значительные изменения ЖКС в процессе роста и старения культур [6]. Например, у разных штаммов Ectothiorho-dospira содержание циклопропановой кислоты Сl9:0cyc составляло 2-3% в экспоненциальной фазе роста и 25-33% в стационарной фазе. Существен-
ное влияние на ЖКС оказывает температура культивирования. На примере пурпурных бактерий семейства Ectothiorhodospiraceae было показано, что увеличение температуры вызывает снижение С18 и ненасыщенных ЖК, в то время как содержание С16 и насыщенных ЖК возрастает [7]. Общие закономерности влияния на ЖКС солености среды были обнаружены при изучении аноксифотобактерий, принадлежащих разным систематическим группам и обладающих разным ЖКС [7]. При солености, близкой к оптимальной, наблюдался минимум содержания С16 и насыщенных ЖК и максимум С18 и ненасыщенных ЖК. Изменение ЖКС происходило как при повышении, так и при понижении солености по отношению к оптимуму.
Однако в большинстве случаев, несмотря на изменения, вызванные условиями культивирования, общая характеристика ЖКС сохраняется, если только клетки не были подвергнуты серьезному стрессу [3]. Например, у культур типового штамма Rhodovulum adriaticum, выращенных при соленостях от 2.5 до 10%, изменения в содержании отдельных ЖК достигали 10%. Тем не менее, эти вариации позволяли на основании ЖКС определить принадлежность штамма к данному виду вне зависимости от условий выращивания. Конечно, для сравнительных целей не следует использовать данные, полученные на угнетенных клетках, выращенных в экстремальных условиях. Влияние перечисленных выше факторов на ЖКС может быть минимизировано выращиванием клеток в стандартных условиях и их использованием для анализа во время экспоненциальной фазы роста.
Многолетний опыт изучения ЖКС бактерий в таксономических целях свидетельствует о том, что разрешающая способность этого критерия существенно варьирует в разных таксонах одного ранга, а эффективность его использования для идентификации существенно зависит от степени изученности данного таксона. В этой связи особый интерес представляет комплексное изучение бактерий разных таксономических групп и сопоставление особенностей их ЖКС с другими фено- и генотипическими характеристиками.
В задачи данного исследования входило: 1) используя стандартные методы, определить ЖКС большого числа штаммов несерных пурпурных бактерий, в том числе близкородственных, выращенных на стандартной среде и в одинаковых условиях; 2) выявить значимые различия ЖКС разных родов, видов и, возможно, штаммов несерных пурпурных бактерий; 3) провести секвенирование 168 рРНК некоторых новых изолятов, в первую очередь, обладающих особым ЖКС; 4) определить таксономический статус ряда исследуемых штаммов, используя в качестве дополнительного критерия характеристику ЖКС.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследовали ЖКС 43 штаммов несерных пурпурных бактерий, относящихся к 6 родам: 5 штаммов Rubrivivax, 17 штаммов Rhodopseudomonas,
3 штамма Rhodoplanes, 5 штаммов Blastochloris,
4 штамма Rhodobium, 9 штаммов Rhodomicrobium. Штаммы Rubrivivax sp. L-4g, SRg, B-6g, KR-55g, H-4g; Rhodopseudomonas sp. KR-31p, KR-32p, KR-63p, KR-91p, KR-103p, KR-109p, KR-111p, ORp, ABp, BORp, MG-3p, UZ-25p; Rhodoplanes sp. KR-62p, KR-108p; Rhodobium sp. KR-36m; Blastochloris sp. KR-70sv, KR-101sv, KR-109sv; Rhodomicrobium sp. KR-19mc, KR-86 mc, KR-88mc, KR-91mc, KR-97mc, KR-105mc, K-1mc, M-6mc выделены Е.И. Компан-цевой и хранятся в лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН (Москва). Штаммы Rhodopseudomonas sp. 121, 124; Rhodoplanes sp. Alt; Rhodobium sp. 992, Scotc; Blastochloris sp. 170 выделены И.Ф. Имхоффом и хранятся в отделе морской микробиологии Института морских исследований им. Лейбница (г. Киль, Германия). В работе использованы также штаммы из международных коллекций: Rhodopseudomonas palustrsis DSM 123T, Rhodopseudomonas sp. R-1 (ATCC 33872, бывший типовой штамм Rhodopseudomonas rutila), Blastochloris viridis DSM 133T, Rhodobium marinum DSM 2698T, Rhodomicrobium van-nielii DSM 162T.
Исследование ЖКС проводили в отделе морской микробиологии Института морских исследований им. Лейбница (Киль, Германия), руководимом профессором И.Ф. Имхоффом.
Бактерии всех штаммов культивировали на среде АТ для несерных пурпурных бактерий [3], содержащей (г/л): KH2PO4 - 1; NH4Cl - 1, Na^O4 - 0.7; MgCl2 ■ 6H2O - 0.5 ; CaCl2 ■ 2H2O - 0.1; NaHCO3 - 3 ; NaCl - 1 ; аскорбат Na - 0.5; ацетат Na - 1. Кроме того, в среду добавляли по 1 мл/л раствора микроэлементов и раствора витаминов, а также 20 мкг/л витамина В12; рН доводили до 7. Соленоводные штаммы Rhodobium sp. выращивали на той же среде, содержащей дополнительно 30 г/л NaCl. В среду для Blastochloris дополнительно вносили 0.5 мМ Na2S ■ 9H2O в виде нейтрализованного продувкой С02 раствора. Среды стерилизовали фильтрованием, разливали во флаконы и выдерживали не менее двух суток перед посевом до полного связывания кислорода аскорбатом Na.
Для культивирования бактерий использовали стеклянные флаконы с завинчивающимися крышками объемом 50 мл. Бактерии всех штаммов выращивали в одинаковых условиях в термостатированной комнате при температуре 25°С и освещенности 2200 лк до поздней экспоненциальной фазы. Для сравнения 5 культур были выращены как при опи-
0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0
8.9
Rubrivivax gelatinosus L4g
Rhodopseudomonas palustris R-1
Rhodopseudomonas palustris DSM 123T
Blastochloris viridis DSM 133T
Rhodopseudomonas sp. UZ-25p -
Rhodoplanes sp. KR-108p
7.3
10
11
15.4
Rhodobium marinum DSM 2698T
Rhodomicrobium vannielii DSM 162T
12.9
68.8
Рис. 1. Евклидово расстояние между исследованными родами и видами несерных пурпурных бактерий.
санных выше условиях, так и при повышенной температуре 35°С. Тестовые культуры, предназначенные для анализа ЖКС, засевали после 4 последовательных пересевов на той же среде. С целью статистической обработки результатов параллельно выращивали 12 тестовых культур каждого штамма. Время культивирования составляло от 24 до 48 ч для разных культур.
Анализ ЖКС осуществляли по методике, предусмотренной Системой Микробной Идентификации (Microbial Identification System), как описано Тиман-ном и Имхоффом [2]. Экстрагированные ЖК переводили в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.