ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 8, с. 1074-1078
УДК 575.116:577.34:636.4
ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ
СРАВНИТЕЛЬНОЕ КАРТИРОВАНИЕ р-ПЛЕЧА ХРОМОСОМЫ 8 АМЕРИКАНСКОЙ НОРКИ (Mustela vison): ЛОКАЛИЗАЦИЯ ТРЕХ BAC-КЛОНОВ ЧЕЛОВЕКА
© 2007 г. Н. С. Жданова
Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск 630090;
факс: (8383) 333-12-78; e-mail: zhdanova@bionet.nsc.ru Поступила в редакцию 02.12.2005 г.
Окончательный вариант получен 29.11.2006 г.
С помощью FISH проведено субхромосомное картирование трех ВАС-клонов человека, локализованных в терминальном районе p-плеча хромосомы 17 человека (HSA 17p13; 1.44-3.68 Мпн), в p-плечо хромосомы 8 американской норки (MVI 8p). Показано, что район, гомеологичный HSA 17p13 в MVI 8p, разбит на три фрагмента, которые были выявлены в терминальном, перицентромерном и, по-видимому, ядрышкообразующем районах. Используя ВАС-клоны человека в качестве гетеро-логичных маркеров для картирования генных последовательностей в хромосомы американской норки, предсказана региональная локализация восьми генных последовательностей: PRPF8, SLC43A2 и RILP в MVI 8p25; C17orf31 в MVI 8p21-22; CARKL, CTNS, TAX1BP3 и P2RX5 в MVI 8р11.
Хромосома 17 человека (HSA 17) представляет собой один из наиболее консервативных районов в геномах млекопитающих. У американской норки он локализован в р-плече хромосомы 8 (MVI 8p) [1]. Ранее, используя неперекрывающиеся микродиссекционные пробы, специфичные к отдельным районам MVI 8p, мы грубо определили ориентацию в MVI 8p района, гомеологичного HSA 17, и показали наличие эволюционной перестройки с точкой разрыва в HSA 17p13 [2]. Чтобы подтвердить или опровергнуть наличие этой перестройки, определить ее тип и координаты в геноме человека, мы с помощью флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) провели локализацию в хромосомы американской норки трех ВАС-кло-нов человека. Для этих клонов известны координаты в геноме человека (1.44-3.68 Мпн), для двух из них известна также цитогенетическая локализация в HSA 17p13 (Clone Registry: http://www.ncbi. nlm.nih.gov/genome/clone/). Сравнение порядка локализации BAC-клонов в HSA 17 и MVI 8p позволило провести сравнительный анализ консервативной синтении района HSA 17р13 и MVI 8p.
Одной из целей сравнительного картирования является предсказание локализации генов у видов, чьи хромосомы картированы с низким уровнем разрешения. Американская норка является объектом пушного звероводства, однако у этого вида имеется только цитогенетическая карта, содержащая 127, в основном генных, маркеров [3]. Для их локализации была использована панель межвидовых гибридов соматических клеток, поэтому, за небольшим исключением, для маркеров была определена только хромосомная локализа-
ция. Дальнейшее насыщение карты норки маркерами затруднено отсутствием у этого вида молекулярных маркеров. Использование гетероло-гичных маркеров, в частности BAC-клонов человека, позволило предсказать в хромосомах норки региональную локализацию ряда генных последовательностей, представленных в использованных ВАС-клонах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для FISH использовали распластанные на предметных стеклах метафазы лейкоцитов периферической крови человека, стимулированных конканавалином А ("Sigma") в рекомендованных концентрациях, а также метафазы фибробластов норки на 1-10 пассажах культивирования. Фиб-робласты норки были получены из ткани легкого. ДНК ВАС-клонов метили био-11-дУТФ в реакции ник-трансляции, используя набор для ник-трансляции ("ООО Медиген", Россия). Характеристика использованных BAC-клонов человека приведена в таблице. Клоны были приобретены в ResGen (Invitrogen Corporation) и любезно предоставлены Матяхиной Л. (Национальный институт здоровья, США). Названия генов в таблице и тексте даны согласно HUGO Gene Nomenclature Committee (http:// www.gene.ucl.ac.uk/cgi-bin/nomenclature/). FISH проводили по стандартному протоколу. Для забивки повторяющихся последовательностей при приготовлении пробы для FISH c хромосомами человека к ДНК BAC-клона кроме фрагментов ДНК спермы лосося добавляли 50-кратное, по сравнению с количеством ДНК BAC-клона, количество Cotl ДНК человека. Гибридизацию прово-
СРАВНИТЕЛЬНОЕ КАРТИРОВАНИЕ р-ПЛЕЧА ХРОМОСОМЫ 8 Локализация ВАС-клонов человека в геноме человека и иа хромосомах американской норки
Клон HSA17 Локализация клона на HSA17 Генный состав клона* Sequence Accession Ids** Локализация гена на HSA17** Локализация клона на MVI 8
начало, Мпн* конец, Мпн*
RP13-321G8 1.44 1.53 p13.3* PRPF8 SLC43A2 RILP AB007510 AJ404317 BC027923 p13.3 p13.3 p13.3 р25-pter
RP11-357O7 1.73 2.24 p13.3* C17orf31 p13.3 p21-22
RP11-601L9 3.25 3.68 OR3A3 OR1E2 CARKL CTNS TAX1BP3 P2RX5 U04688 AF163573 U04686 AF028823 AJ222967 AF016709 p13.3 p13.3 p13.3 p13 p13 p13.3 p11
* Clone Registry: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/clone/. ** HUGO Gene Nomenclature Committee: http://www.gene.ucl.ac.uk/cgi-bin/nomenclature/.
дили в течение суток. При приготовлении пробы для гибридизации с хромосомами американской норки дополнительно добавляли Cotí ДНК норки в таком же количестве, как и Cotí ДНК человека. Гибридизацию на хромосомах человека проводили в течение суток, а на хромосомах норки - в течение 2-3 суток. Пробы визуализировали с помощью системы авидин-FITC - биотинилированные антитела козы к авидину - авидин-FITC ("Vector") [4]. Для анализа изображения использовали эпи-флуоресцентный микроскоп Axioskop 2 ("Carl Zeiss", Germany), оснащенный CCD-камерой (CV M300, JAI Corporation, Japan), набором фильтров CHROMA и системой для анализа изображения MetaSystemsGroup, Inc., USA, Центра коллективного пользования Института цитологии и генетики СО РАН. Идентификацию района мечения осуществляли на окрашенных DAPI хромосомах американской норки согласно номенклатуре Ман-дала и Фредги [4, 5], а на хромосомах человека -согласно международной классификации хромосом [6].
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис. 1 приведены данные по локализации ВАС-клонов RP13-321G8, RP11-357O7 и RP11-601L9 в хромосомы человека и американской норки. Все три клона были локализованы нами в HSA 17p13, что соответствует их характеристикам по Clone Registry (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ genome/clone/) (таблица). У американской норки клоны были локализованы в районы: RP13-
32Ш8 (1.44-1.53 Мпн) - в MVI 8р25^ег; ИР11-35707 (1.73-2.24 Мпн) - в MVI 8р21-р22 и ИР11-60^9 (3.25-3.68 Мпн) - в MVI 8р11 (таблица, рис. 1, 2). Полученные данные свидетельствуют о том, что район, гомеологичный ША 17р13 (1.443.68 Мпн), представлен в МУ1 8р тремя фрагментами, локализованными в разных районах МУ! 8р.
ОБСУЖДЕНИЕ
Одна из наиболее вероятных моделей происхождения изучаемого консервативного района предполагает, что в геноме предка млекопитающих, а возможно и тетрапод, район, гомеологичный ША 17, был отдельной хромосомой [7, 8]. В кариотипе американской норки произошло, очевидно, слияние двух предковых хромосом, представленных в кариотипе человека хромосомами 17 и 13 [1]. Согласно данным по гибридизации неперекрывающихся микродиссекционных проб к отдельным районам МУ1 8р с хромосомами человека, район МУ1 8рсеп-р21 гомеологичен району ША 17р, за исключением терминального района этого плеча (ША 17pter-p13), а район МУ1 8р21^ег гомеологичен ША 17q вместе с районом ША 17pter-p13. Полученные нами данные и данные, приведенные в нашем предыдущем исследовании [4], уточняют структуру в МУ1 8р района, гомео-логичного р-плечу хромосомы ША 17, и свидетельствуют о том, что в районе МУ1 8р11-р21-22, позиционированном в ША 17 в положении 3.2524.49 Мпн, не содержится крупных перестроек по
... ггт „ ^ * Ê 0 / // / ■
1a 16 2a 26 3a 36
f«4 V'4 • . ' f * L. m Ж* \\ >\ m В
* - lA
4a
46
5a
56
6a
66
Рис. 1. Гибридизация in situ с хромосомами американской норки (1-3) и человека (4-6) ВАС-клонов человека RP13-321G8 (1, 4), RP11-357O7 (2,5) и RP11-601L9 (3, 6); а - локализация метки, б - DAPI окрашивание. Представлены фрагменты метафазных пластинок в черно-белом инвертированном виде.
сравнению с соответствующим районом в хромосоме человека.
Известно, что у американской норки в районе 8p21 локализован ядрышкообразующий район [2, 4]. Таким образом, положение ядрышкового организатора в MVI 8p соответствует положению перицентромерного района в HSA 17 (рис. 2). Следует заметить, что, за исключением американской норки, другие изученные виды млекопитающих, в том числе и человек, не содержат ядрышковый организатор в изучаемом консервативном районе.
Учитывая сказанное выше, нам кажется наиболее вероятным следующее предположение по поводу реконструкции района HSA 17pter-p13 в геноме норки. При формировании MVI 8 район, гомеологичный HSA 17 pter-p13, был частично делетирован, что неизбежно при слиянии хромосом терминальными районами, а частично вошел в состав перицентромерного района. При этом эволюционный разрыв оказался локализованным между 2.24 и 3.25 Мпн в координатах генома человека (NCBI BUILT 35). Делетированный район, в свою очередь, распался как минимум на два фрагмента, которые были выявлены нами в MVI 8p21-p22 и в MVI 8p25-pter (рис. 2). Как было указано выше, район MVI 8p21-p22 содержит ядрышкообразующий район, а MVI 8p25-pter является терминальным для данного консервативного района. Таким образом, реконструкция в геноме норки района, гомеологичного HSA 17pter-p13, по-видимому, была тесно связана с формированием центромерного, ядрышкообразующего и терминального районов хромосомы 8.
Достижения последних лет по секвенирова-нию геномов млекопитающих и созданию радиационных карт высокого уровня разрешения позволили провести сравнительный анализ одновременно нескольких геномов. В этот анализ было включено восемь видов плацентарных млекопитающих из разных отрядов. Было установлено, что существуют районы хромосом, наиболее часто участвовавшие в эволюционных перестройках геномов, среди них выделяются терминальные и перицентромерные районы [9]. Полученные нами данные укладываются в эти представления о закономерностях реорганизации геномов млекопитающих.
Согласно данным Clone Registry (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/genome/clone/)
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.