БИОХИМИЯ, 2012, том 77, вып. 8, с. 1033 - 1043
УДК 577.112
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ПРОТЕОМНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГЛИКОПРОТЕИНОВ ИЗ КЛЕТОК МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Hs578BST И РАКА ГРУДИ Hs578T, А ТАКЖЕ ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ И ДЕЙСТВИЯ а-ПОЛИПЕПТИДА II ПРОЛИЛ 4-ГИДРОКСИЛАЗЫ В РАКОВЫХ КЛЕТКАХ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ*
© 2012 г. Пенг Вей Пен1, Куи Цзанг2**, Фанг Бей2, Джи Хау2, Генг Бей12
1 College of Life Sciences, State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology and Tianjin Key Laboratory of Molecular Drug Research, Nankai University, Tianjin, 300071, China
2 College of Pharmacy, State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology and Tianjin Key Laboratory of Molecular Drug Research, Nankai University, Tianjin 300071, China; fax: +86(222)350-8371, E-mail: qizhang@nankai.edu.cn
Поступила в редакцию 17.02.12 После доработки 02.03.12
Для идентификации гликопротеинов, специфичных для клеток рака груди, мы получали с помощью лентил лектина N-связанные гликопротеины из раковых клеток (линия Hs578T) и из нормальных клеток (линии Hs578BST) молочной железы человека и сравнивали их методом двумерного электрофореза. Обнаружено 24 гликопротеина, по-разному экспрессированные в норме и при раке, и установлено, что 9 из них принимают участие в биосинтезе коллагена. В дальнейшем была изучена экспрессия а-полипептида II пропил 4-гидроксилазы (P4HA2) и его действие в раковых клетках молочной железы. Иммуногистохимический анализ показал, что количество P4HA2 в клетках опухоли молочной железы было увеличено по сравнению с клетками соседней нормальной ткани. Кроме того, в результате экспериментов по сверхэкспрессии P4HA2 и трансфекции в раковые клетки интерферирующей shPHK, было установлено, что повышение содержания P4HA2 в клетках Hs578T сопровождалось угнетением их пролиферации и торможением клеточной миграции in vitro.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: гликопротеомика, лектин, рак молочной железы, P4HA2.
Гликозилирование является одним из важнейших способов посттрансляционной модификации белков эукариотических клеток [1, 2] и играет значительную роль в различных биологических процессах [3]. Аберрантное гликозили-рование наблюдается почти во всех типах экспериментальных и естественных злокачественных опухолей человека и активно изучается для установления его взаимосвязи с опухолевым перерождением, пролиферацией и метастазировани-ем клеток [4—7]. Изучение изменений гликопро-теинового состава клеток при развитии злокачественных опухолей может способствовать луч-
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM12-034, 08.04.2012.
** Адресат для корреспонденции.
шему пониманию механизмов канцерогенеза. В последние годы методы протеомики широко используются для обнаружения специфических опухолевых белков и идентификации предполагаемых опухолевых маркеров [8, 9].
Гликопротеины лектиновой группы имеют высокое сродство к углеводам. Лектины являются идеальными зондами, узнающими структуру углеводов, и широко используются для обнаружения и очистки различных гликопротеинов. Лен-тил лектин (ЬСИ, лектин кулинарной чечевицы) специфично узнает гликопротеины и гликопеп-тиды, содержащие структуры, включающие в себя Бис а1—6 асМАс, а-Б-^с и а-Б-Мап [10, 11]. ЬСИ ранее уже был использован при глико-протеомическом анализе в качестве специального зонда для связывания и идентификации а1-6-фукозилированных белков печени человека [12].
Ранее было продемонстрировано, что в опухолях молочной железы система гликозилиро-вания претерпевает значительные изменения [13]. В представленном исследовании для выделения гликопротеинов из клеток раковой опухоли груди (№5781) и нормальных клеток молочной железы (№578681) была использована ЬСИ-сефароза 4В. Белковый состав полученных препаратов гликопротеинов анализировали методом двумерного электрофореза и последующей масс-спектрометрией с детекцией времени пролета ионов (МЛЬБМОР/ТОР М8). В результате была идентифицирована группа из 24 гликопротеинов, экспрессия которых значительно варьировалась в клетках двух линий, причем 9 из этих белков имеют отношение к процессу формирования коллагена, в том числе к его биосинтезу и посттрансляционной модификации. Среди них были обнаружены пролил 4-гидроксилазы (Р4Иазы) коллагена, катализирующие образование остатков 4-гидроксипро-лина, играющих центральную роль в стабилизации третичной структуры молекулы этого фибриллярного белка.
Коллагеновые Р4Иазы позвоночных животных являются 2а2р-тетрамерами и представлены тремя изозимными формами в зависимости от типа их каталитических а-субъединиц (Р4ИЛ), содержащих субстрат-связывающий домен и активный центр. Функция р-субъеди-ницы (Р4ИВ) заключается в поддержании а-субъединицы в растворимой форме и активном состоянии [14]. Среди трех изоформ а-цепи гидроксилазы форма Р4ИЛ1 превалировала в подавляющем большинстве типов клеток; форма Р4ИЛ2 обнаруживалась главным образом в хондроцитах, остеобластах и клетках эндотелия капилляров; форма Р4ИЛ3 являлась минорной [15]. Ранее было показано, что уровень экспрессии Р4ИЛ2 изменен в опухолях различных типов, включая сквамозную карциному ротовой полости и папиллярный рак щитовидной железы, поэтому выдвинуто предположение о ее участии в поведении опухолевых клеток [16, 17]. Настоящая работа посвящена изучению экспрессии Р4ИЛ2 и выяснению ее влияния на пролиферацию и миграцию клеток рака молочной железы линии №578Т.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Подготовка образцов. Клетки линий №578Т и №578В8Т (другие названия ИТВ-126 и ИТВ-125 соответственно) были получены в Американской коллекции клеточных культур. Собранные клетки разрушали ультразвуком, гомогенат ин-
кубировали 1 ч на льду и затем центрифугировали при 14 000 об/мин 20 мин при 4°. Образцы су-пернатанта (5 мл) отбирали (примерно 20 мг белка при сравнении с БСА) диализовали в течение ночи при 4° против буфера для связывания (20 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 1 мМ CaCl2 и 1 мМ MnCl2) и наносили на колонку с LCH-сефарозой 4В («GE Healthcare», США), уравновешенную тем же буфером. После инкубации в течение ночи при 4° колонку трижды промывали буфером для связывания. Гликопро-теины элюировали 20 мМ Tris-HCl-буфером pH 7,4, содержавшим 0,15 M NaCl, 0,1%-ный Triton X-100, 1%-ный дезоксихолат, 0,1 M a-D-метилманнозид и 0,1 M a-D-метилглюкозид и собирали в объеме 5 мл.
Двумерный электрофорез. Гликопротеины (по 200 мкг белка каждого образца) осаждали с использованием набора для очистки Ready-Prep™ 2-D Cleanup Kit («Bio-Rad», США) и перерастворяли в 400 мкл регидрирующего раствора (8 M мочевина, 2 M тиомочевина, 4%-ный CHAPS, 0,5%-ный буфер для изофокусирования с амфолинами, 18 мМ дитиотреитол). Образец белка наносили на две полоски геля длиной 17 см («GE Health», США), содержащего амфолины в диапазонах pH 4—7 и 6—9. Изоэлектрофокуси-рование, переуравновешивание гелей и Ds-Na-ПААГ-электрофорез во втором направлении проводили как написано в инструкции фирмы производителя. Белки окрашивали серебром с помощью набора Fast Silver Stain Kit («Beyotime», Китай).
Протеолиз белков и MALDI-TOF/TOF масс-спектрометрия. После проведения препаративного электрофореза белковые пятна вырезали из геля, обесцвечивали и проводили переваривание белков с помощью трипсина («Promega», США). Пептиды экстрагировали смесью 60%-ного аце-тонитрила, 0,1%-ного ТФУ и лиофилизовали. Спектры MS и MS/MS были получены с использованием протеомного анализатора ABI 4800 MALDI-TOF/TOF («Applied Biosystems», США). Анализ результатов проводили с помощью базы данных Unipro tKB/SwissProt с использованием программного обеспечения GPS Explorer, version 3.6 и MASCOT version 2.1.
ПЦР в режиме реального времени и иммуно-блоттинг. ПЦР в режиме реального времени выполнена с использованием набора SYBR Premix EX Taq II kit («TaKaRa», Япония), а данные были получены и проанализированы на системе Eppendorf Mastercycler ep realple («Eppendorf», Германия). Праймеры для P4HA1: 5'-CAAAGA-CTGGGGAAGCAGAA-3' (смысловой) и 5'-CC-TCTCGTCCCACTTTCCA-3' (антисмысловой). Праймеры для P4HA2: 5'-AGCTCAGGACAC-
CAAACCAG-3' (смысловой) и 5'-CTTCCTGC-CTCAGGTATTGC-3' (антисмысловой). Прайме-ры для GAPDH (глицеральдегид 3-фосфатдегид-рогеназа) : 5 ' - GTGAAGGTCGGAGTCAACG- 3 ' (смысловой) и 5'-TGAGGTCAATGAAGGGGTC-3' (антисмысловой).
Цельные клеточные лизаты были приготовлены с использованием буфера для радиоиммунного приципитационного анализа (RIPA, 25 мМ Tris-HCl, pH 7,6, 150 мМ NaCl, 1%-ный NP-40, 1%-ный дезоксихолат натрия, 0,1%-ный Ds-Na). После проведения Ds-Na-электрофореза в 8%-ном ПААГ белки переносили на поливинилиден-фторидные мембраны (PVDF) и визуализовали их с использованием первичных антител против P4HA1 («Sigma»), против P4HA2 («Abgent»), против P4HB и вторичных антител («Santa Cruz»).
Иммуногистохимическое окрашивание было использовано для оценки уровня экспрессии белка P4HA2 в раковых опухолях молочной железы и прилегающих к ним нормальных тканях. Парафинированные срезы тканей («Shanghai Outdo Biotech Co., Ltd.», Китай) обрабатывали антителами против P4HA2 («Abgent», США) в разведении 1 : 100. Интенсивность иммуногис-тохимического окрашивания оценивали как слабую (1), умеренную (2) и высокую (3). Долю иммунореактивных клеток оценивали по следующим категориям: (0) — <5% реактивных клеток, (1) — 5—25% реагирующих клеток, (2) — 26—50% реактивных клеток, (3) — 51—75% реактивных клеток, (4) — >75% реактивных клеток. Итоговая количественная оценка иммуногисто-химической реактивности ткани для каждого случая складывалась из суммы оценок доли реагирующих клеток и общей интенсивности им-мунохимического окрашивания. Разницу в экспрессии P4HA2 между различными образцами клеток подтверждали с помощью i-теста Стью-дента. Значение Р < 0,05 считали статистически достоверным.
Сверхэкспрессия P4HA2- и РНК-интерференция. Ген белка P4HA2 был амплифицирован из кДНК раковых клеток линии HS578T. В качестве праймеров использовали: 5'-CGCGGATC-CATGAAACTCTGGGTGT-3' (смысловой) и 5 ' -CCGCTCGAGTCAGTCAACTTCTGTT-3' (антисмысловой). После выщепления с помощью рестриктаз BamH I и Xho I амплифицированный ген был встроен в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.