ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2014, № 2, с. 123-132
= ГЕНЕТИКА =
УДК 575.17:575.853'316,7:576.316.7:582.736
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ТЕТРАПЛОИДНЫХ ФОРМ Matricaria chamomilla L. И Matricaria inodora L.
© 2014 г. Т. Е. Саматадзе*, **, А. В. Амосова*, С. Н. Суслина**, Т. Н. Загуменникова*** , Н. В. Мельникова*, В. А. Быков***, А. В. Зеленин*, О. В. Муравенко*
*Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991 Москва, ул. Вавилова, 32 **Российский университет дружбы народов, 117198Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6 ***Всероссийский институт лекарственных и ароматических растений РАСХН, 117216 Москва, ул. Грина, 7
E-mail: tsamatadze@gmail.com Поступила в редакцию 01.04.2013 г.
C помощью DAPI-бэндинга, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с зондами 26Sи 5SрДНК и анализа мейоза проведено сравнительное цитогенетическое изучение автотетраплоидного сорта Подмосковная ромашки аптечной Matricaria chamomilla L. (M. recutita L.) и дикорастущей тетрапло-идной ромашки непахучей M. inodora L. В кариотипах обеих форм по рисункам DAPI-бэндинга и распределения 26S и 5S рДНК идентифицированы все хромосомы и построены видовые идиограм-мы M. chamomilla и M. inodora с учетом полиморфных вариантов рисунков DAPI-бэндинга и указанием расположения сайтов 26S и 5S рДНК.
DOI: 10.7868/S0002332913060131
Ромашка аптечная Matricaria chamomilla L. (2n = 18, где n — число хромосом) — одно из самых древних лекарственных растений, принадлежащих к семейству сложноцветных, или астровых (Compositae = Asteraceae) (Растительные ресурсы СССР, 1993). Цветочные корзинки ромашки аптечной содержат до 0.8% эфирного масла, в состав которого входят хамазулен, сесквитерпено-вые спирты (бизаболол, бизабололоксид, кето-спирт) и углеводороды (фарнезен, кадинен), а также каприновая кислота (Коновалова, Рыбалко, 1982). Это растение в России возделывается с 1953 г., но дефицит такого лекарственного сырья для фармацевтической промышленности, возрастающий с каждым годом (Чиков, 2005), требует получения новых сортов с высоким содержанием эфирного масла.
Известно, что полиплоидия вызывает разнообразные изменения свойств растительных организмов (Stebbins, 1971). Это позволяет получить богатый исходный материал для создания новых высокопродуктивных форм растений. Как правило, полученные искусственным путем тетрапло-идные формы растений содержат больше биологически активных веществ по сравнению с диплоидными формами, чем обусловливается целесообразность выращивания именно таких перспективных форм. Тетраплоидные формы получают с использованием различных физических и химических мутагенных факторов (Глазова и др., 1971). У тетраплоидных форм ромашки аптечной наблюдается увеличение размеров генеративных органов и повышение содержания наибо-
лее ценных компонентов эфирного масла (Глазова, 1977; Seidler-Loz 'ykowska, 2003).
Полиплоиды обнаружены и среди дикорастущих родственных видов ромашки. К ним относится ромашка непахучая, или трехреберник непахучий, M. inodora L. (Tripleurospermumperforatum (Merat) M. Lainz = Matricaria perforata Merat, Tripleurospermum inodorum (L.) Sch.Bip.) (2n = 36). Предполагают, что этот вид является естественным автотетраплоидом (Arora, Madhusudana, 1981; Саматадзе и др., 1998). Химический состав цветков, листьев и стеблей M. inodora близок к таковому у M. chamomilla (Greger, 1975; Раал и др., 1987), что позволило использовать этот вид в народной медицине, хотя и не так широко, как ромашку аптечную (Махлаюк, 1967).
Числа хромосом 2n = 18 и 36 у различных видов рода Matricaria были установлены многими исследователями (Lundegardh, 1909; Tischler, 1935, 1937; Maude, 1939; Tarnavschi, 1948; Koul, 1964a, b; Болховских и др., 1969; Ростовцева, 1979; Peneva et al., 1988; Abd El-Twab et al., 2008). С помощью методов С- и OR-дифференциального окрашивания у некоторых видов ромашек были идентифицированы хромосомы и представлены их идио-граммы (Саматадзе и др., 1997, 1998; Муравенко и др., 1998; Samatadze et al., 2001; Муравенко, Зеленин, 2009). Вместе с тем геномы ромашек практически не исследованы с помощью флуоресцентной гибридизации in situ и других современных цитогенетических подходов.
Применение молекулярно-цитогенетических методов для исследования митотических и мейо-тических хромосом ромашки аптечной и родственных ей видов позволит получить дополнительные сведения о структурно-функциональной организации их геномов. Это будет способствовать получению ответов на вопросы, связанные как с таксономией и эволюцией различных видов ромашек (Rauschert, 1974; Hansen, Christensen, 2009; Inceer, Trabzon, 2010), так и с селекцией новых сортов ромашки аптечной.
Известно, что для полиплоидов характерно наличие более двух геномов, поэтому в момент конъюгации хромосом в мейозе могут возникать различные сложные ассоциации, объединяющие гомологичные хромосомы (Stebbins, 1971; Mendes-Bonato et al., 2002; Ghaffari, 2006). В популяциях искусственного (M. chamomilla) и естественного (M. inodora) тетраплоидов спонтанно могут возникать триплоидные и анеуплоидные растения. Изучение хромосомных ассоциаций в мейозе исследуемых тетраплоидных форм ромашек важно для более глубокого понимания тет-раплоидной природы генома M. inodora и оценки стабильности генома тетраплоидного сорта Подмосковная.
С использованием методов DAPI-дифферен-циального окрашивания, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с зондами генов рРНК и анализа мейоза проведено изучение геномов искусственной тетраплоидной формы ромашки аптечной (сорт Подмосковная) и тетраплоида естественного происхождения — ромашки непахучей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследования послужили образцы семян растений M. chamomilla (сорт Подмосковная) (2n = 36) и M. inodora (2n = 36), выращенных в Ботаническом саду ВИЛАР РАСХН. Сорт ромашки аптечной Подмосковная был получен методом колхицинирования и последующего отбора (Глазова и др., 1971).
Предобработку корневых меристем интерка-лятором ДНК — 9-аминоакридином (9 АМА) — и приготовление давленных хромосомных препаратов проводили согласно модифицированным методикам, описанным ранее (Samatadze et al., 2001; Muravenko et al., 2003, 2009; Муравенко, Зеленин, 2009). Для изучения мейоза препараты готовили, используя вариант методики, разработанный ранее (Саматадзе и др., 2012а).
FISH с зондами 26S и 5S рДНК проводили по ранее усовершенствованной методике (Семенова и др., 2006). Пробу 26S рДНК метили биотином с помощью набора Biotin-Nick Translation Mix (Roche, Швейцария), а пробу 5S рДНК — дигок-сигенином с помощью набора DIG-Nick Transla-
tion Mix (Roche) в соответствии с протоколом производителя. Сайты гибридизации зонда 26S рДНК выявляли с использованием флуоресце-инсвязанного авидина (Vector Laboratories, Великобритания). Для усиления сигнала использовали биотинилированный антиавидин (Vector Laboratories, Великобритания) с повторным нанесением флуоресцеинконъюгированного авидина. Сайты гибридизации зовдд 5S рДНК выявляли с использованием антител к дигоксигенину, конъюгиро-ванных с родамином (Roche). Для усиления сигнала применяли антитела, конъюгированные с флуоресцентным красителем Cy3, входящим в класс красителей CyDye. После процедуры детекции препараты споласкивали в PBS-буфере, обезвоживали, проводя через серию этилового спирта 70%—85%—96%, высушивали в темноте и заключали в среду Antifade Vectashield (Vector Laboratories).
Для окрашивания как мейотических, так и ми-тотических хромосом ромашки в среду для заключения препаратов Vectashield (Vector Laboratories) добавляли 0.125 мкг/мл флуорохрома DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол). Это позволило получить DAPI- дифференциальную окраску ме-тафазных хромосом и монохромное окрашивание мейотических хромосом.
Просмотр препаратов, отбор хромосомных пластинок и их анализ проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus BX61, снабженного черно-белым прибором с зарядовой связью — камерой CoolSnap (RoperScientific Inc., США). Анализировали не менее 15 выбранных метафазных пластинок с хорошим разбросом хромосом из каждой исследуемой формы ромашки. Полученные изображения обрабатывали с использованием программы для хромосомного анализа согласно технологии, принятой в лаборатории (Муравенко, Зеленин, 2009). Идентификацию хромосом в кариотипах проводили по рисунку окрашивания с учетом морфологии и в соответствии с цитологической классификацией, разработанной ранее для монохромно окрашенных и С-диффе-ренциально окрашенных хромосом M. chamomilla и M. inodora (Саматадзе и др., 1997, 1998).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В кариотипах обеих изучаемых форм ромашки содержатся в основном метацентрические хромосомы (2n = 36), размер которых колеблется от 3.2 до 6.4 мкм (рис. 1). Выявленные на метафазных хромосомах M. chamomilla и M. inodora рисунки флуоресцентного DAPI-окрашивания в целом были аналогичны рисункам С-бэндинга хромосом этих видов ромашек, что позволило идентифицировать хромосомы в их кариотипах и разделить их по геномам в соответствии с разработанной ранее классификацией (Саматадзе и др.,
CPAВHИTЕЛЬHОЕ ЦИTОГЕHЕTИЧЕCKОЕ ИЗУЧЕHИЕ
125
V
« ^
■ .
* — i L
С*
с/л
•<*>' Vf
> л а
ï 4 í V
¿A /V
•О"» ^ . (%
tSV. .
-
Vs
(а)
_l (б)
Рис. 1. DAPI-дифференциально окрашенные метафазные пластинки хромосом M. chamomilla сорт Подмосковная (а) и M. inodora (б) (2n = 4х = 36). Масштаб: 5 мкм.
10
11
12
13
14
15
1б
17
18
Рис. 2. Идиограммы и кариотип DAPI-дифференциально окрашенных хромосом M. chamomilla сорта Подмосковная (а) и M. inodora (б). Числа для рис. 2 и 4 — номера хромосом.
1997, 1998) (рис. 2). Геном искусственного авто- M. inodora был обозначен нами как М', что обыч-тетраплоида M. chamomilla был представлен двумя но применяется при обозначении геномов расте-М^-субгеномами (Саматадзе и др., 1997). Геном ний (Dewey, 1984). Несмотря на то что геном
Тип хромосомных ассоциаций и пределы их варьирования в диакинезе у M. chamomilla и M. inodora
Вид Число Число проанализи- Ассоциации и пределы их варьирования
хромосом (2n) рованных клеток I II III IV
M. c
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.