ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 5, с. 784-789
УДК 581.1:547.963
СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ФОСФОЛИПИДНОГО СОСТАВА ЯДЕРНЫХ СУБФРАКЦИЙ ЗАРОДЫШЕЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ ПРОРАСТАНИИ
© 2004 г. Л. А. Минасбекян, Ж. В. Явроян, М. Р. Дарбинян*, П. О. Вардеванян
Кафедра биофизики и * кафедра биохимии Ереванского государственного университета, Ереван Поступила в редакцию 21.10.2003 г.
Исследовано содержание фосфолипидов в составе хроматина, ядерного матрикса и ядерной мембраны зародышей пшеницы (ТгШсит авзйуит Ь.). Показано, что ядерные субфракции интактных ядер сухих зародышей различаются по составу и содержанию отдельных фосфолипидов. При прорастании семян происходит перераспределение фосфолипидов в ядерных субфракциях. Обсуждается функциональная роль структурных изменений, происходящих в ядерной мембране вследствие перераспределения фосфолипидов, и предполагается, что это может приводить к изменению проницаемости ядерной мембраны и заряда на ее поверхности.
ТгШсит авзйуит - ядра - ядерный матрикс - ядерная мембрана - фосфолипиды
Молекулярные механизмы регуляции генома и связанного с его состоянием ядерного транспорта все еще остаются до конца не выясненными [1]. В ряде работ показано, что ядерный матрикс может влиять на процессы, протекающие в ядре, начиная с момента фиксации при репликации ДНК, что обеспечивает высокую степень организации первичной транскрипции и контроля направленного транспорта РНК в цитоплазму через ядерные поры [2, 3]. Известно также, что основные белковые компоненты ядерного матрикса -негистоновые белки, связаны с молекулами фосфолипидов, которые, будучи вовлеченными в процесс генной регуляции, участвуют в структурных перестройках ДНК и нуклеопротеиновых комплексов [4-6]. В то же время фосфолипидные компоненты во всех субфракциях ядра играют важную роль в связывании ДНК с ядерным мат-риксом и мембраной [7, 8]. Ранее мы отмечали происходящее при активации генома набухание ядер и перераспределение поверхностного заряда ядерной мембраны [9], что, по нашему предположению, может быть также следствием изменения в фосфолипидном составе самой ядерной мембраны.
Сокращения: ФС - фосфатидилсерин; ЛФХ - лизофосфати-дилхолин.
Адрес для корреспонденции: Вардеванян Погос Оганесович. 375025 Армения, Ереван, ул. А. Манукяна, 1. Ереванский государственный университет, кафедра биофизики. Электронная почта: simvar@arminco.com
Целью данной работы было проведение сравнительного анализа фосфолипидного состава ядерных субфракций - хроматина, ядерного матрикса и ядерной мембраны, полученных из изолированных интактных ядер сухих и прорастающих зародышей пшеницы, для выявления структурно-функциональной роли.
МЕТОДИКА
Выделение зародышей из семян гексаплоид-ной пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Безос-тая-1 проводили по методу Johnston и Stern [10]. Семена измельчали в течение 15-20 с при 1400 g в гомогенизаторе MPW-302 ("Mechanika precyzyj-na", Польша) и последовательно просеивали через ряд сит (с порами 3, 2 и 1 мм). Массу, оставшуюся на 1-миллиметровом сите, брали для проращивания зародышей.
Зародыши проращивали на жидкой питательной среде, содержащей 5 мМ Трис-НС1-буфер, pH 7.4, 20 мМ KCl и 20 мкг/мл сахарозы, а также на твердой питательной среде, содержащей 0.9% агара, 1% глюкозы и 0.01% стрептомицина. Зародыши проращивали в предварительно стерилизованных чашках Петри в темноте при 26°С в течение 72 ч.
Ядра из изолированных эмбрионов семян получали по модифицированному нами методу Blo-bel и Potter [11]. Сухие эмбрионы или замороженные в жидком азоте проростки измельчали в ступке до получения тонкого порошка, добавляли 0.25 М сахарозы в буфере, содержащем 10 мМ
Фосфолипидный состав (мкг/мг сухого веса) субфракций интактных ядер из сухих эмбрионов и 3-дневных проростков
Фосфо-липид Ядерная мембрана Растворимая ядерная фракция Хроматин
сухие эмбрионы проростки сухие эмбрионы проростки сухие эмбрионы проростки
ФХ 0.545 ± 0.08 0.385 ± 0.03 0.407 ± 0.09 0.166 ± 0.04 0.710 ± 0.22 0.585 ± 0.02
ФЭ 0.310 ± 0.09 0.230 ± 0.01 0.179 ± 0.08 0.128 ± 0.03 0.263 ± 0.19 0.329 ± 0.02
ФИ 0.151 ± 0.08 0.180 ± 0.02 н.о. н.о. 0.135 ± 0.11 0.174 ± 0.01
ФС 0.149 ± 0.07 0.195 ± 0.02 н.о. н.о. 0.130 ± 0.11 0.367 ± 0.02
ФК 0.359 ± 0.10 0.910 ± 0.02 0.288 ± 0.07 0.128 ± 0.05 н.о. н.о.
КЛ 0.366 ± 0.08 0.175 ± 0.02 0.244 ± 0.12 0.740 ± 0.01 0.101 ± 0.09 0.140 ± 0.01
ЛФХ н.о. н.о. н.о. н.о. 0.119 ± 0.04 0.135 ± 0.02
Сумма 1.880 2.075 1.098 1.162 1.458 1.730
Примечание. В таблице представлены средние арифметические величины из 4 независимых экспериментов и их стандартные отклонения. ФХ - фосфатидилхолин, ФЭ - фосфатидилэтаноламин, ФИ - фосфатидилинозитол, ФС - фосфатидилсерин, ФК - фосфатидная кислота, КЛ - кардиолипин, ЛФХ - лизофосфатидилхолин. н.о. - не обнаружено.
Трис-НС1, 25 мМ КС1, 15 мМ М§С12, рН 7.4 (ТКМ-буфер), фильтровали сквозь марлю и центрифугировали 10 мин при 9000 g на центрифуге 310В ("МесИатка ргесу7у]па"). Осажденные ядра повторно отмывали, как описано в работе [9]. Полученный в результате осадок представлял собой фракцию очищенных интактных ядер. Для дальнейшего фракционирования ядер и получения ядерных мембран осадок интактных цельных ядер разбавляли буфером, содержащим 50 мМ Трис-НС1 (рН 7.4), 1% Тритона Х-100, 400 мМ КС1 и далее действовали согласно методике, описанной в работе [9]. Осажденные ядерные мембраны отмывали 2-3-кратным ресуспендировани-ем в ТКМ-буфере с 0.25 М сахарозы и центрифугировали в течение 15 мин при 27000 g в центрифуге ЦВР-1("МРТУ-42", СССР).
Для выделения хроматина брали как сухие, так и проросшие на питательной среде зародыши. Хроматин выделяли по описанной ранее методике [12]. "Грубый хроматин", полученный после осаждения сульфатом аммония, дважды промывали в буфере, содержащем 10 мМ Трис-НС1 (рН 7.4), 10 мМ КаС1, 3 мМ М§С12 и 0.1 мМ фенилметил-сульфонилфторида.
Экстракция фосфолипидов и их количественное определение. Фосфолипиды экстрагировали из ацетоновых порошков хроматина, а также ядерной мембраны и растворимой ядерной фракции смесью хлороформ : метанол (2 : 1) по методу Фолча с соавт., как описано в работе [13]. Фракционирование индивидуальных фосфолипидов проводили хроматографически в тонком слое си-ликагеля Ь ("СИетаро1", Чехия) в системе растворителей хлороформ : метанол : вода в соотноше-
нии 65 : 25 : 4 (по объему) в присутствии маркеров -ФХ, ФЭ и кардиолипина ("Sigma", США). Хрома-тограммы проявляли в парах йода. Содержание фосфолипидов определяли по фосфору после 2-часовой минерализации отдельных фосфолипидных фракций в присутствии смеси HClO4 и HNO3 по методу Ames [14].
В таблицах представлены средние арифметические величины из 4 независимых экспериментов и их стандартные отклонения.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
К настоящему времени получены данные по фосфолипидному составу многих растительных объектов [15-17], однако фосфолипидный состав растительного хроматина и ядерной мембраны еще недостаточно изучен. Самыми распространенными фосфолипидами в эукариотических клетках являются фосфатидилхолин (лецитин) и фосфатидилэтаноламин. Количество этих двух основных фосфолипидов в эукариотических клетках может достигать соответственно 50 и 25% всей фосфолипидной массы [18], однако в разных растениях они содержатся в разных соотношениях [19].
Результаты проведенных нами исследований фосфолипидного состава показали, что фосфолипиды ФХ и ФЭ представлены во всех субфракциях ядра. В таблице приведен фосфолипидный состав ядерной мембраны, растворимой ядерной фракции и фракции очищенного хроматина, выделенных из сухих эмбрионов пшеницы. Как видно из этих данных, содержание ФХ и ФЭ в растворимой ядерной фракции ниже, чем в составе ядер-
50 40
« 30 н
5 20
*
6 10
и о о
о
iB 70
Л 60
0
Ядерная мембрана
Ш]
н о
50 40 30 20
я
о
д
g 10 § 0 ■f 50
Ф 40 ¡1 30 Н 20 10
Растворимая ядерная фракция
Хроматин
[LD
ш, т,
ФХ ФЭ ФИ ФС ФК К ЛФХ
Доли фосфолипидов в составе ядерной мембраны, растворимой ядерной фракции и хроматине сухих (1) и проросших (2) эмбрионов пшеницы. ФХ - фосфатидилхолин, ФЭ - фосфатидилэтанола-мин, ФИ - фосфатидилинозитол, ФС - фосфатидил-серин, ФК - фосфатидная кислота, КЛ - кардиоли-пин, ЛФХ - лизофосфатидилхолин.
ной мембраны, что находится в соответствии с данными других экспериментов, выявивших присутствие фермента (холин/этаноламинфосфот-рансферазную активность) CEPT-1, ответственного за синтез ФХ и ФЭ в ядерной мембране и эн-доплазматическом ретикулуме [18]. Как видно из таблицы, для всех трех субфракций интактных ядер, полученных из сухих зародышей, ФХ является мажорным фосфолипидом. Относительное содержание ФХ в ядерной мембране составляет 28.9%, в растворимой ядерной фракции - 37%, а в хроматине - 49%. ФЭ также обнаружен во всех трех субфракциях ядра, но в случае ядерной мембраны - в количествах, не превышающих содержание ФК и кардиолипина (рисунок).
Возникает вопрос, почему именно в ядерной мембране необходимо присутствие фермента, осуществляющего синтез ФХ de novo. Основная функция ядерной мембраны - сохранить целостность своей поверхности и поверхностный заряд для обеспечения избирательной проницаемости ядерных пор [3, 18, 20]. Ранее, на основании исследований электрокинетических свойств интакт-
ных ядер различных видов и сортов пшеницы, мы получили данные об изменении заряда поверхности ядра [9]. Было показано, что на первых стадиях развития эмбриона поверхностный заряд ядерной мембраны интактных ядер семян у разных злаков увеличивается в разной степени [9]. Известно, что ФХ и ФЭ по молекулярной форме и строению в водном окружении относятся к цилиндрическим липидам и обладают способностью к образованию двухслойных мембран [20]. Изгибы мембраны могут возникать вследствие относительного насыщения коническими (диацилгли-церолом, холестеролом и ФК) или перевернуто-коническими липидами (лизофосфатидилхоли-ном, ЛФХ) [20]. Это может приводить к положительному или отрицательному искривлению бис-лоя мембраны, в зависимости от распределения этих липидов во внутреннем или внешнем слое.
Из данных, приведенных в таблице, видно, что в составе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.