ЖУРНАЛ ФИЗИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2007, том 81, № 5, с. 930-935
БИОФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
УДК 577.150.3
СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ И СВОЙСТВ ß-ГАЛАКТОЗИДАЗ
© 2007 г. О. М. Полторак, Е. С. Чухрай, О. С. Пилипенко, Л. Ф. Атякшева, А. Е. Берегалов
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Химический факультет
E-mail: poltorak@phys.chem.msu.ru Поступила в редакцию 05.04.2006 г.
Проведено сравнение аминокислотных последовательностей ß-галактозидазы из E. coli и еще четырех ß-галактозидаз микроорганизмов, отобранных из 11, проанализированных на первом этапе. Показано, что функциональные аминокислотные остатки в каталитическом домене и лигандное окружение катионов магния сохраняются во всех пяти последовательностях. Методом нуклеофильного конкурирования исследован механизм каталитического действия ß-галактозидаз из E. coli и K. lactis. Показано, что механизм действия нуклеофильных агентов кинетически одинаков для обоих ферментов: присутствие метанола или бутандиолов влияет на стадию дегалактозилирования; присутствие катионов магния увеличивает активность обеих ß-галактозидаз; механизм термоинактивации ß-галактозидаз из K. lactis и E. coli различен.
в-Галактозидаза (КФ 3.2.1.23) - гидролитический фермент, отщепляющий концевые остатки P-D-галактозы в в-галактозидах. в-Галактозида-зы, выделенные из различных источников, относят к семействам 1, 2, 35 и 42 гликозил-гидролаз. В основе классификации на семейства лежит информация о последовательности аминокислотных остатков в молекуле фермента: в семейство объединяют гомологичные белки, степень идентичности которых превышает 30% [1]. В настоящее время известны аминокислотные последовательности ~50 в-галактозидаз из различных источников, около половины из них принадлежат к семейству 2 гликозил-гидролаз. Пространственная структура четырех в-галактозидаз исследована методом рентгеноструктурного анализа (РСА). Один из этих ферментов - бактериальная в-га-лактозидаза из Escherichia coli - принадлежит к семейству 2. В соответствии с РСА-данными [2], в-галактозидаза из E. coli представляет собой плоский гомотетрамер, молекулярная масса каждого протомера 116 кД. В растворе тетрамер может диссоциировать на составляющие его структуры [3]. Семейство 2 гликозил-гидролаз объединяет в основном бактериальные в-галактозидазы, к этому семейству принадлежит также и дрожжевая в-галактозидаза Kluyveromyces lactis. Олиго-мерный состав в-галактозидазы из K. lactis исследован в работе [4]. Выделены тетра-, три-, ди- и мономеры фермента, причем каталитически активны только тетра- и димеры. Бактериальная в-галактозидаза из E. coli и дрожжевая в-галактозидаза из K. lactis - объекты экспериментального настоящего исследования.
Цель данной работы - провести с помощью известных компьютерных программ сравнение аминокислотных последовательностей в первичной структуре ß-галактозидаз из различных источников с ферментом из E. coli, определить степень их идентичности в различных участках молекулы и, особенно, в строении активного центра; провести сравнительное исследование влияния различных факторов (катионов металлов, нуклеофильных агентов) на активность и механизм каталитического действия ß-галактозидаз из E. coli и K. lactis; изучить основные закономерности термоинактивации ß-галактозидазы из K. lactis и сравнить их с результатами проведенных ранее исследований для бактериального фермента из E. coli.
За последние годы накоплен значительный объем информации о структуре ферментов, принципах формирования активных центров и механизмах их действия. Эта информация сконцентрирована в различных базах данных, использованию которых для анализа ферментов и нахождения их активных центров посвящена обзорная статья [5]. По мере появления многочисленных баз данных, содержащих первичные структуры белков, стали появляться компьютерные программы, позволяющие проводить сравнение аминокислотных последовательностей белков. Результаты такого сравнения могут оказаться весьма информативными, поскольку первичная структура в значительной степени определяет третичную структуру белка и его физико-химические свойства. Множественное выравнивание белковых последовательностей с помощью таких программ позволяет выделить в них домены, проявляющие наибольшее сходство между собой. Одна из таких программ - AMPS
Таблица 1. Степени идентичности (%) аминокислотных последовательностей различных в-галактозидаз из семейств 2, 35, 42 и 1, полученные в результате попарного сравнения в программе AMPS
Источник фермента 2 35 * 42 1
бактерии дрожжи грибы бактерии
E. coli Kleb. pn. Strep. th. Therm. Th. Kl. Lactis Penicill sp. Asp. niger Xant. Man. Leu. lactis Therm A4 Sulf. so
E. coli 100
Kleb. pn. 59 100
Strep. th. 34 33 100
Therm. Th. 23 22 26 100
Kl. Lactis 32 30 32 26 100
Penicill. sp 13 14 12 20 13 100
Asp. niger 13 12 13 20 14 68 100
Xant. Man. 23 26 22 15 21 27 15 100
Leu. lactis 38 35 50 16 34 22 23 15 100
Therm. A4 26 26 22 15 23 23 23 17 15 100
Sulf. so 27 28 25 18 24 28 26 17 15 18 100
* Эта ß-галактозидаза не относится ни к одному из 99 семейств гликозил-гидролаз.
(Alignment of Multiple Protein Sequences) [6] - использована в данной работе.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Для попарного сравнения аминокислотных последовательностей из аннотированного банка данных было отобрано 11 ß-галактозидаз из различных микроорганизмов (бактерии, грибы, дрожжи), относящиеся к различным семействам гликозил-гидролаз. Результаты этого сравнения приведены в табл. 1.
В экспериментальном исследовании использованы бактериальная ß-галактозидаза из E. coli и дрожжевая ß-галактозидаза из K. lactis. Бактериальный фермент представлял собой лиофилизи-рованный препарат (Sigma) с содержанием белка 80% и активностью 597 ед/мг. Дрожжевая ß-галак-тозидаза из K. lactis фирмы "Novozyme Corp." -раствор фермента в глицерине, его активность 3000 ед/мл, содержание белка 20 мг/мл.
Для определения активности ферментов использовали синтетические субстраты - о- и п-нит-рофенил^^-галактопиранозид (о-НФГ и п-НФГ) фирмы "Sigma". Продукты реакции гидролиза о-или п-нитрофенол определяли спектрофотомет-рически. Реакцию проводили в фосфатном буферном растворе, рН 7.5
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Сравнение аминокислотных последовательностей различных ß-галактозидаз. В табл. 1 представлены результаты первого этапа множествен-
ного сравнения последовательностей в программе AMPS (попарное сравнение 11 в-галактозидаз различных микроорганизмов).
Результаты проведенного сравнения показали, что степень идентичности в пределах одного семейства составляет 20-30%. Высокая степень идентичности (~60%) была получена при сравнении бактериальных ферментов из E. coli и Klebsiella pneumoniae. Эти ферменты существуют в виде тетрамеров с близкими молекулярными массами (116 и 117 кДа) [2, 7] и являются родственными белками, произошедшими от одного предшественника. Идентичность двух других бактериальных в-галактозидаз Streptococcus thermophilus и Leuconostoc lactis также высока и составляет 50%. Степень идентичности аминокислотных последовательностей в-галактозидаз грибного происхождения из Penicillium sp. и Aspergilus niger составляет 68%. Известно, что оба эти фермента существуют в форме активного мономера [8, 9]. Строение в-галактозидаз из E. coli и Penicillium sp. значительно отличается. По данным РСА фермент из E. coli - гомотетрамер [2], а фермент из Penicillium sp. [8] - мономер. Степень идентичности этих в-галактозидаз невелика и составляет всего 13%. Наибольший вклад в степень идентичности, по всей видимости, вносят третий и первый домены, выполняющие каталитическую функцию.
в-Галактозидаза дрожжевого происхождения (K. lactis) по степени идентичности аминокислотных последовательностей ближе к бактериальным, чем к грибным ферментам. У дрожжевой в-галактозидазы K. lactis и бактериальной E. coli помимо достаточно высокой степени идентично-
Таблица 2. Структура активной молекулы, число аминокислотных остатков в мономере (N) и молекулярная масса мономера (M, кДа) в-галактозидаз, исследованных на втором этапе анализа в программе AMPS
Источник фермента Структура N M
E. coli тетра- и димер 1023 116
Klebsiella pneumoniae тетрамер 1034 118
Streptococcus thermophilus тетра- и димер 1026 117
Leuconostoc lactis димер 626 72
Kluyveromyces lactis тетра- и димер 1025 118
Таблица 3. Параметры уравнения Михаэлиса-Ментен для реакций гидролиза о- и и-НФГ ß-галактозидазами из E. coli и K. lactis (vmax, мкмоль/(мин мг E))
Источник о-НФГ и-НФГ
фермента KM, мМ ^max KM, мМ ^max
E. coli 0.1 5.0 0.06 1.9
K. lactis 1.4 1.9 3.2 28.6
сти и принадлежности к семейству 2 есть и другие общие свойства: у них близкие молекулярные массы мономеров (116 и 118 кДа), каталитически активными единицами обоих ферментов являются ди- и тетрамеры.
Для дальнейшего сравнения с ß-галактозида-зой E. coli из 10 ферментов, представленных в табл. 1, можно отобрать четыре, степень идентичности которых высока. Считается, что для корректного сравнения, которое учитывает биологические и химические свойства белков достаточно степени идентичности ~30% [6]. За основу сравнительного анализа принят порядковый номер аминокислотного остатка и схематичное изображение элементов вторичной структуры ß-галактозидазы из E. coli. Выделены абсолютно идентичные участки и участки сравниваемых последовательностей белков, когда сходство с учетом свойств аминокислотных остатков превышает 50%. Структурные характеристики ß-галактози-даз, исследованных на втором этапе, представлены в табл.2.
Обнаружено, что в областях вторичных структур, образующих центральное ядро в молекуле ß-галактозидазы из E. coli, наблюдается значительная гомология последовательностей других ß-галактозидаз, возможно, свидетельствующая и о пространственном сходстве. Проведенный анализ позволяет по аналогии с ферментом из E. coli установить в других ß-галактозидазах возможные функциональные аминокислотные остатки. Оказалось, что функциональные аминокислотные остатки в каталитическом домене сох
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.