научная статья по теме СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ АНАЛЬГЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ДЕРМОРФИНА, [DPRO6]-ДЕРМОРФИНА И ИХ С-КОНЦЕВЫХ ТРИПЕПТИДОВ Биология

ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 5, с. 577-582

ФИЗИОЛОГИЯ животных ^^^^^^^^^^^^ И ЧЕЛОВЕКА

УДК 612.821:615.214

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ АНАЛЬГЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ДЕРМОРФИНА, деРго6]-ДЕРМОРФИНА И ИХ С-КОНЦЕВЫХ ТРИПЕПТИДОВ

© 2007 г. Л. С. Гузеватых*, Т. А. Воронина*, Т. Г. Емельянова**, Л. А. Андреева***, П. С. Громовых***, Н. Ф. Мясоедов***, С. Б. Середенин*

* Институт фармакологии им. В.В. Закусова РАМИ, 125315 Москва, ул. Балтийская, 8 ** Институт химической физики им. ИИ. Семенова РАИ, 117977 Москва, ул. Косыгина, 4 *** Институт молекулярной генетики РАИ, 123182 Москва, пл. Курчатова, 46

E-mail: gulucy@km.ru Поступила в редакцию 12.09.2006 г.

Проведено сравнительное изучение анальгетической активности дерморфина (ДМ), [DPro^-ДМ и их C-концевых трипептидов. Анальгетическое действие оценивали в тестах отдергивания хвоста, горячей пластины, зажима основания хвоста, формалиновых болей крыс и уксусных корчей у мышей, характеризующих различный уровень организации болевой чувствительности. Показано, что внутрибрюшинное введение пептидов приводит к снижению порога болевой чувствительности во всех перечисленных тестах. Установлено, что C-концевые трипептиды ДМ5-7 и рРго6]-ДМ5_7 обладают анальгетической активностью, сопоставимой с активностью целых молекул, а в ряде случаев даже ее превышающей. Эффект ДМ, ^Рго6]-ДМ, и C-концевых фрагментов дМ5-7 и уменьшается при совместном введении с налоксоном, что указывает на опиоидную природу анальгетической активности пептидов.

Дерморфин Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2 (ДМ) - природный эндогенный опиоидный пептид, выделенный из кожи южноамериканской лягушки Phyllomedusinae, обладает высокой анальгетической активностью, превышающей эффективность морфина в 10-25 раз (Broccardo et al., 1981; Castiglione et al., 1981; Rossi et al, 1983; Stevens, Yaksh, 1986; Braga et al., 1984). Укорочение молекулы ДМ с C-конца приводит к уменьшению его анальгетической активности, а минимальным фрагментом, необходимым для ее проявления, является N-концевой тетрапептид (Broccardo et al, 1981). ДМ обладает высоким сродством к ц-опиатным рецепторам. Его высокая специфичность обеспечивается особенностями пространственной конфигурации. Моделирование низкоэнергетических конформаций ДМ в растворе показало, что пептид имеет в основном складчатую структуру. Присутствие DAla2 в молекуле может приводить к образованию N-конце-вого, а Pro6 - C-концевого ^-поворотов (Pattabira-man et al., 1986). Структурно-конформационная селективность была описана для многих соединений и оказалось, что ^-поворот и в-складка играют важную роль в селективности по отношению к ц- и 5-опиатным рецепторам (Renugopalakrish-nan, Rapaka, 1988; Rapaka et al., 1988; Scatturin et al., 1985). Показано, что N-концевая часть молекулы ДМ (Tyr-DAla-Phe-Gly) требуется лиганду для проявления его полной опиатной активности

(Cucumel et al., 1996). Значение C-концевого фрагмента (Tyr-Pro-Ser) для проявления анальгетической активности считалось несущественным (Коршунова, Сумбатян, 1989). Однако было показано, что стереохимическая модификация Pro6 в молекуле ДМ приводит к значительному усилению его антиноцицептивной активности (Гузеватых и др., 2002; Broccardo et al., 2003). Поэтому значение C-концевого трипептида ДМ в проявлении им анальгетического действия нельзя считать окончательно понятным.

Цель настоящего исследования - сравнительное изучение анальгетической активности ДМ, [DPro6]-ДМ и их С-концевых трипептидов на тест-моделях, характеризующих различные типы болевой чувствительности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили самцы нелинейных белых крыс массой 180-250 г и самцы беспородных мышей массой 20-22 г. В работе использовали пептиды, синтезированные в Институте молекулярной генетики РАН (Москва):

Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2 и его фрагмент Tyr-Pro-Ser-NH2 - (ДМ5-7);

Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-DPro-Ser-NH2 - ([DPro6]-ДМ) и его фрагмент Tyr-DPro-Ser-NH2 - ([DPro6]-

ДМ5-7)

Пептиды вводили внутрибрюшинно (в/б) в виде водного раствора за 20 мин до тестирования. Объем вводимого раствора составлял 1 мл/кг веса крыс и 10 мл/кг веса мышей. Контрольные животные получали инъекцию эквивалентного объема дистиллированной воды. Пептиды вводили в диапазоне доз 0.1-10 мг/кг веса животного. Животные использовались однократно. Каждая экспериментальная группа состояла из 10-15 животных. Всего было проведено 50 экспериментов, в которых использовано 600 крыс и 150 мышей.

Изучение анальгетической активности пептидов осуществляли в тестах: отдергивания хвоста, горячей пластины, уксусных корчей, формалиновых болей и зажима основания хвоста. Тест отдергивания хвоста. Болевое раздражение моделировали погружением хвоста крысы в горячую воду с температурой 56 ± 0.1°С (D'Amor, Smith, 1941). Латентный период (ЛП) отдергивания хвоста (время избавления от болевого раздражителя) определяли до введения, каждые 20 мин в течение первого часа и каждые 30 мин в течение следующего часа. Изменения латентного периода (ДЛП) рассчитывали по формуле:

ДЛП = ЛП; - ЛПисх,

где ЛП; - величина ЛП, зафиксированная в i-й момент времени; ЛПисх - исходное время отдергивания хвоста - среднее арифметическое из трех показателей, зафиксированных за 30, 20 и 10 мин до инъекции (D'Amor, Smith, 1941).

Одновременно проводилась оценка нарастающих сумм ЛП отдергивания хвоста (площадь под кривой в табл. 1 и 5) за указанное время. Эта интегральная оценка более устойчива, чем измерения в отдельных временных точках и чувствительна к функциональному состоянию животных. Аналогичный подход использовался в тесте горячей пластины (табл. 2).

Тест корчей, вызванных уксусной кислотой. Исследования проводили на самцах мышей. Животных помещали в индивидуальные боксы. Регистрировали число корчей после введения 0.6%-ного раствора уксусной кислоты (из расчета 10 мл на 1 кг веса животного) на протяжении 30 мин (Chernov et al., 1967). Тест зажима основания хвоста. Болевое раздражение вызывали механическим раздражением основания хвоста крыс. В экспериментах оценивали врожденную оборонительную реакцию крыс на защемление корня хвоста специальным зажимом Гаффнера по модифицированной методике (Haffner, 1929), используя 4-балльную шкалу: 0 - отсутствие реакции, 1 - вздрагивание, 2 - побежка вперед, 3 -скручивание к основанию хвоста и кусание зажима. Тест формалиновых болей. Острую болевую воспалительную реакцию воспроизводили суб-плантарным (под подошвенный апоневроз) вве-

дением 50 мкл 5%-ного формалина. За 20 мин до субплантарного введения формалина крысам опытной группы в/б вводили изучаемое соединение, а животным контрольной группы - эквивалентный объем дистиллированной воды. Животных помещали в индивидуальные боксы. Регистрировали число болевых реакций (постукивание лапой об пол, грызение лапы и т.д.) в первые 5-10 мин (I фаза воздействия на первичные афференты боли) и с 30-й по 50-ю мин (II фаза - боль, возникающая в результате воспалительной реакции) (Bannon et al., 1998). Тест горячей пластины. Крысу помещали на разогретую до 53.5°С металлическую поверхность. Регистрировали время от момента посадки до первого облизывания задней лапы (Woolfe, Magdonald, 1944). Измерения проводили каждые 20 мин по три раза до и после введения пептида. Для дальнейших вычислений использовали усредненное значение исходной болевой чувствительности и значения приобретенной болевой чувствительности отдельно по каждому измерению.

Результаты экспериментов и интегральные оценки статистически обрабатывали, используя непараметрический критерий Вилкоксона-Ман-на-Уитни в статистических пакетах программ Microsoft Excel и Статистика 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В тесте отдергивания хвоста у контрольной группы животных порог болевой чувствительности не изменялся. Через 20 мин после введения дистиллированной воды ЛП реакции составил 0.5 ± 0.2 с, через 40 мин - 0.4 ± 0.2 с, через 60 мин -0 ± 0.2 с, через 90 мин - 0.2 ± 0.1 с и через 120 мин -0.4 ± 0.3 с. ДМ проявлял дозо-зависимое анальге-тическое действие. В дозе 1.0 мг/кг достоверные отличия наблюдались только на 20-й мин, а в дозе 10.0 мг/кг в течение всего времени наблюдения. ^Рго6]-ДМ также обладал дозо-зависимым анальгетическим эффектом во всех исследуемых дозах. При введении пептида в дозах 0.1 и 1.0 мг/кг достоверные отличия регистрировались на 20-90-й мин после введения, а в дозе 10.0 мг/кг также как и для ДМ, в течение всего периода наблюдения (табл. 1).

Как видно из табл. 1 С-концевой трипептид ДМ5-7 вызывал дозо-зависимое уменьшение болевой чувствительности. Выраженность эффекта С-концевого трипептида ДМ в дозах 0.1 и 1.0 мг/кг была выше, чем у самого ДМ. С-конце-вой фрагмент ^Рго6]-ДМ5-7 также обладал отчетливо выраженной дозо-зависимой анальгетической активностью. По выраженности эффекта ^Рго6]-ДМ5-7 уступал активности ^Рго6]-ДМ (табл. 1).

сравнительный анализ анальгетическои активности

•,6-1

579

Таблица 1. Анальгетическая активность ДМ, ^Рго6]-ДМ и их С-концевых трипептидов в тесте отдергивания хвоста

Пептид Доза, мг/кг Изменение порога болевой чувствительности (с) после введения препарата Площадь под кривой за 60 мин, усл. ед.

20 мин 40 мин 60 мин 90 мин 120 мин

Контроль 0.5 ± 0.2 0.4 ± 0.2 0.0 ± 0.2 0.2 ± 0.1 -0.4 ± 0.3 24

ДМ 0.1 -3.0 ± 0.9 0.4 ± 0.2 0.6 ± 0.1 0.2 ± 0.1 0.2 ± 0.1 44*

1.0 3.4 ± 1.3* 1.9 ± 0.8 1.7 ± 0.8 0.2 ± 0.2 0.05 ± 0.05 155*

10.0 2.8 ± 1.1* 3.8 ± 1.3* 8.1 ± 3.5* 5.1 ± 1.2* 4.2 ± 2.2* 657*

^Рго6]-ДМ 0.1 2.2 ± 1.2* 4.8 ± 1.9* 3.7 ± 1.0* 2.5 ± 1.3* 1.0 ± 0.5 375*

1.0 5.7 ± 3.1* 7.5 ± 3.1* 5.4 ± 1.7* 4.0 ± 2.1* 0.2 ± 0.1 558*

10.0 11.0 ± 4.3* 13.6 ± 6.9* 12.9 ± 5.2* 6.6 ± 2.5* 4.4 ± 1.2* 1131*

Туг-Рго^ег-Ш2 0.1 5.0 ± 2.4* 4.4 ± 2.6* 2.0 ± 1.5* 1.1 ± 0.6 0.9 ± 0.4 285*

1.0 4.1 ± 2.8* 5.1 ± 2.3* 4.7 ± 2.6* 3.6 ± 1.2* 1.8 ± 0.6 457*

10.0 6.3 ± 3.6* 4.6 ± 1.1* 4.0 ± 1.9* 3.8 ± 1.9* 1.6 ± 0.8 456*

Туг^Рго^ег-Ш2 0.1 6.0 ± 3.4* 5.7 ± 2.5* 2.0 ± 1.2* 0.9 ± 0.3 0.4 ± 0.2 317*

1.0 5.7 ± 2.9* 4.1 ± 2.6* 3.0 ± 1.8* 2.5 ± 1.1* 1.0 ± 0.2 361*

10.0 7.3 ± 3.1* 3.0 ± 1.4* 4.0 ± 0.2* 3.1 ± 2.2* 2.1 ± 1.0* 451*

* Дос

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.