МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2012, том 46, № 2, с. 269-275
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ^^^^^^^^^^^^^^ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 579.25:578.81
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ АНТИРЕСТРИКЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ БЕЛКОВ АгЛА И Лгав, КОДИРУЕМЫХ генами трансмиссивной
ПЛАЗМИДЫ Я64 (1пс11)
© 2012 г. В. П. Балабанов, К. С. Пустовойт, Г. Б. Завильгельский*
Государственный научный центр "ГосНИИгенетика", Москва, 117545 Поступила в редакцию 20.06.2011 г. Принята к печати 05.07.2011 г.
Антирестрикционные белки АгйА и АМВ специфически ингибируют ферменты рестрикции-модификации типа I. Проведено клонирование генов ardЛ и yfeB (агйВ) из трансмиссивной плазмиды Я64 в векторах риС18 и pZE21. Белки АгйА и АМВ ингибируют только рестрикционную активность фермента ЕсоК1. Показано, что белок АМВ, в отличие от АгйА, ингибирует рестрикционную активность ЕсоК1 лишь при высокой внутриклеточной концентрации. Антирестрикционная активность белка А^В не зависит от активности протеазы С1рХР. Ген yfeB (агйВ) в плазмиде Я64 экспрессируется со слабого промотора, расположенного перед предшествующим геном у/еА.
Ключевые слова: антирестрикционные белки, ферменты рестрикции-модификации типа I, трансмиссивная плазмида, АгйА, АгЙВ.
COMPARATIVE ANALYSIS OF ANTIRESTRICTION ACTIVITY OF R64 ArdA AND ArdB PROTEINS, by V. P. Balabanov, K. S. Pustovoit, G. B. Zavilgelsky* fState Research Center "GosNIIgenetika", Moscow, 117545 Russia; *e-mail: zavilgel@genetika.ru). Antirestriction proteins ArdA and ArdB are specific inhibitors of the type I restriction-modification enzymes. The transmissible plasmid R64 ardA and yfeB(ardB) genes were cloned in pUC18 and pZE21 vectors. It was shown that the R64 ArdA and ArdB proteins inhibit only restriction activity of the type I restriction-modification enzyme (EcoKI) in Escherichia coli K12 cells. The dependence of the effectiveness of the antirestriction activity of the ArdA and ArdB proteins on the intracellular concentration was determined. Antirestriction activity of ArdB is independent from the ClpXP protease. Transcription of yfeB (ardB) gene in R64 plasmid is realized from the yfeA promoter.
Keywords: antirestriction protein, type I restriction-modification enzymes, transmissible plasmid, ArdA, ArdB.
Гены ardA (alleviation of restriction of ^NA) ответственны за синтез небольших по размеру (160—170 аминокислотных остатков), очень кислых (суммарный заряд —25...—30) антирестрикци-онных белков ArdA [1—4]. Расположены гены ardA в лидерной области трансмиссивных (конъ-югативных) плазмид, они одними из первых входят в клетку-реципиент при конъюгативном переносе ДНК [3, 4]. Белки ArdA ингибируют одновременно как рестрикционную (эндонуклеазную), так и мо-дификационную (метилазную) активность ферментов [3, 4]. Пространственная структура белков ArdA подобна структуре двухцепочечной ДНК в В-форме и, следовательно, ArdA относятся к семейству ДНК-мимикрирующих белков (protein mimicry of DNA) [5].
Впервые ген ardB был обнаружен в трансмиссивной плазмиде pKM101 (IncN) [6]. Оказалось, что белок ArdB, в отличие от ArdA, ингибирует
* Эл. почта: zavilgel@genetika.ru
только рестрикционную (эндонуклеазную) активность ферментов рестрикции-модификации типа I. При изучении генетической структуры трансмиссивной плазмиды ЯК2 (1псРа) [7] обнаружили ген, кодирующий белок, гомологичный АгёВ, однако не обладавший антирестрикцион-ной активностью. При повышенной концентрации этот белок ингибировал рост клеток, поэтому он был отнесен к группе белков-киллеров, получив наименование К1сА.
В настоящее время ОепВапк содержит несколько тысяч нуклеотидных и, соответственно, аминокислотных последовательностей, гомологичных АгёВ и К1сА (и получивших соответствующие наименования), обнаруженных у бактерий различных видов и семейств, причем как в геноме, так и в составе трансмиссивных плазмид. Белки АгёВ и К1сА состоят из 140—150 аминокислотных остатков, их суммарный заряд равен —5...—7. Белки вариабельны по первичной структуре, но содержат в определенных сайтах консервативные
аминокислотные остатки. Однако фенотипиче-ские характеристики (антирестрикция, или киллер-эффект) у этих белков не определены. Лишь в 2010 г. клонировали несколько генов — ardB и klcA, и определили основные характеристики соответствующих им белков [8]. Оказалось, что при значительной вариабельности первичной структуры, эти белки содержат консервативные аминокислотные остатки, от которых зависит образование их уникальной трехмерной структуры — компактной глобулы в форме тетраэдра. Все шесть исследованных белков проявляли антирестрик-ционную (но не антимодификационную) активность и, в отличие от KlcA (RK2), не обладали киллерными свойствами.
В настоящей работе клонирован ген yfeB (ardB) (GenBank Accession no BAB91625.1) из трансмиссивной плазмиды R64 (IncIl), и определены антирестрикционные свойства кодируемого им белка. Причина выбора этого гена двоякая. Во-первых, белок, кодируемый этим геном, несмотря на слабую гомологию с белком ArdB (pKM101), содержит консервативные аминокислотные остатки (F20, L21, W51, L140, R17, E35, D61, R125, E133, D141), отмеченные ранее [8]. Во-вторых, мы показали, что в состав плазмиды R64 входит ген ardA, причем кодируемый им белок ArdA уникален, поскольку в отличие от стандартных белков ArdA он ингибирует, как и ArdB, лишь рестрикционную активность ферментов рестрикции-модификации типа I [9]. В настоящей работе мы охарактеризовали также экспрессию гена yfeB (ardB) в природной плазмиде R64.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Бактериальные штаммы, бактериофаги и плазмиды. В работе использовали штамм Escherichia coli K12 MG1655 ZI, хромосома которого содержит ген, кодирующий TetR, белок-репрессор промотора PeA. Этот штамм получен трансдукци-ей с помощью фага P1; в качестве донора использовали клетки E. coli DH5aZ1 tetR, в геноме которых ген tetR тесно (90% котрансдукции) сцеплен с геном, определяющим резистентность бактерии к спектиномицину.
В работе использовали также следующие штаммы E. coli K-12: JM109 recAl endAl gyrA96 thi supE44 relA1 hsdR17 A(lac-proAB) [F'traD36proAB lacIqZ AM15]; TG-1 thi relA supE44 hsdR17 hsdM A(lac-proAB) [F'traD36proAB lacIqZ AM15] (получены из коллекции "ГосНИИгенетика"); AB1157 F- thr-1, leu-6, proA2, his-4, thi-1, argE3, lacY1, galK2, ara14, xyl-5, mtl-1, tsx-33, rpsL31, supE44, r+m+; NK113 AclpP::cat и NK114 AclpX::kan, остальные маркеры как у AB 1157 (получены от N.E. Murray, Англия).
Бактериофаг Р1 получен из коллекции "ГосНИИгенетика", бактериофаг ^vir — от R. Devoret
(Франция). В работе использовали немодифици-рованные фаги ^.0 и модифицированные фаги ^.к, выращенные на E. coli TG-1 и E. coli K-12 AB1157 соответственно.
Источником генов ardA и yfeB (ardB) служила трансмиссивная плазмида R64 (IncI1) из коллекции "ГосНИИгенетика".
В качестве вектора, содержащего строго регулируемый промотор, использовали вектор серии pZ с репликоном ColE1 pZE21 Knr [10]. В качестве строго регулируемой промоторной-операторной области в данный вектор встроен фрагмент ДНК, содержащий Р11еЮ-1.
В работе использовали также векторы pUC18 и T-вектор pTZ57R. Силу промотора оценивали с использованием беспромоторного вектора pDEW201, содержащего сенсор — кассету luxCDABE Photo-rhabdus luminescens [11].
Cреды, ферменты, реактивы. Для выращивания культур и в опытах с клонированием использовали L-бульон и L-агар. В питательные среды добавляли антибиотики — ампициллин (100 мкг/мл), ка-намицин (40 мкг/мл), хлорамфеникол (15 мкг/мл). Реакции расщепления и лигирования проводили с использованием ферментов фирмы "Fermentas" (Литва). Трансформацию клеток E. coli проводили кальциевым методом согласно [12]. Экспрессию генов в штамме E. coli MG1655Z1 с гибридными плазмидами серии pZ индуцировали ангид-ротетрациклином ("Aldrich Sigma").
Конструирование плазмид. Источником генов ardA и yfeB (ardB) служила плазмида R64. Эндо-нуклеолитическое расщепление, лигирование фрагментов ДНК, электрофорез в агарозном геле, выделение фрагментов ДНК из агарозного геля проводили согласно [12]. Ген yfeB (ardB) клонировали с использованием в качестве праймеров следующих олигонуклеотидов с последующим накоплением продуктов с помощью ПЦР:
ardB-Ndir 5'-TGTTCCGGAATATGTGAACAACG-3'; ardB-Nrev 5'-CCGGATCCGTTAATCAGTCCAGA-3'.
Ген ardA клонировали с использованием в качестве праймеров олигонуклеотидов ardA-Ndir и ardA-Nrev:
ardA-Ndir 5'-CTGGGATCCGGGAATGTCTGTTGTTGC-3';
ardA-Nrev 5'-CATTCTGCAGCGGGGGAGTAAATCACCG-3'.
Праймеры подбирали согласно полной нуклео-тидной последовательности плазмиды R64 [13].
На первом этапе гены ardA и yfeB (ardB) встраивали в вектор pTZ57R и затем по сайтам Xbal— BamHI переносили в вектор pUC18. В результате были сконструированы плазмиды pVB1 (содержит ardA) и pVB2 (содержит ardB).
На втором этапе гены ardA и yfeB (ardB) переклонировали в вектор pZE21 под контроль строго регулируемого промотора PItetO-1. Фрагменты ДНК в вектор встраивали по сайтам KpnI и HindIII.
Антирестрикционную и антимодификационную активность белков ArdA и ArdB измеряли с использованием штаммов E. coli K-12 AB1157 (с гибридными плазмидами на основе вектора pUC18) и MG1655Z1 (с гибридными плазмидами на основе pZE21). Клетки штаммов AB1157 и MG1655Z1 содержат активную систему рестрикции—модификации типа I EcoKI (R2M2S), клетки штамма JM109 содержат метилазную форму M2S.
Методика измерения антирестрикционной и антимодификационной активностей белков семейства Ard описана в [3, 14].
Измерение интенсивности биолюминесценции.
Экспрессию генов, расположенных в векторе pZE21, в зависимости от концентрации индуктора — ангидротетрациклина — измеряли при помощи сконструированной ранее гибридной плазми-ды pZE21-lux [11]. В этой плазмиде под промотором PltetO-i расположена кассета luxCDABE c генами-репортерами, кодирующими люциферазу Р. luminescens. Интенсивность биолюминесценции суспензии клеток измеряли на люминометре, состоящем из фотоумножителя ФЭУ-85 и микровольтметра В2-15, в специальных кюветах при комнатной температуре и объеме суспензии 200 мкл.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Конструирование гибридных плазмид
Гены ardA и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.