БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 2, с. 348-354
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ
УДК 612.815+616-092:616.155.194.7
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ДЕЙСТВИЯ СВОБОДНОГО И ДЕПОНИР ОВАННОГО NO НА СО СТОЯНИЕ ПР О -И АНТИОКСИДАНТНЫХ СИ СТЕМ КР ОВИ
© 2015 г. А.К. Мартусевич, А.Г. Соловьева, С.П. Перетягин*, А.Ф. Ванин**
Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии Минздрава России, 603155, Нижний Новгород, Верхне-Волжская наб., 18/1; *А ссоциацияроссийских озонотерапевтов, 603089, Нижний Новгород, ул. Б. Панина, 9; **Институт х имической физики им. Н.Н. Семенова РАН, 119991, М осква, ул. Косыгина, 4
E-mail: сту$1-таП@уапйех.ги Поступила в p едакцию 21.04.14 г.
Изучена динамика окислительного метаболизма крови здоровых доноров (п = 30) под влиянием оксида азота в газообразном виде и в форме динитрозильных комплексов железа. В образцах крови определяли интенсивность процессов липопероксидации и уровень малонового диаль-дегида в плазме и эритроцитах, антиоксидантный потенциал плазмы и уровень супероксид-дисмутазной активности. Проведенные исследования впервые позволили установить особенности реагирования про- и антиоксидантных систем крови в условиях in vitro на обработку монооксидом азота в свободной и депонированной (в составе динитрозильных комплексов железа) форме. Они включают выраженное прооксидантное действие для газового потока от аппарата «Плазон», умеренно нивелирующееся при десятикратном разведении NO-содержащей смеси. П рименение экспериментального генератора оксида азота, разработанного в Российском федеральном ядерном центре, демонстрирует минимальную прооксидантную активность, а водный раствор динитрозильных комплексов железа характеризуется умеренным антиокси-дантным действием, реализующимся в плазме крови как ограничение процессов липоперок-сидации, а в эритроцитах - за счет повышения супероксиддисмутазной активности.
Ключевые слова: оксид азота, динитрозильные комплексы железа, кровь, липопероксидация, биохемилюминесценция, супероксиддисмутазная активность.
Известно, что молекула монооксида азота (N0), являясь биорадикалом, способна вступать в различные реакции с органическими соединениями и активными формами кислорода [1-4]. В результате этого, в зависимости от текущего уровня N0 [5,6], могут проявляться либо его биорегуляторная активность, либо токсические эффекты, главным образом обусловленные синтезом пероксинитрита ^N00") [7,8]. Напротив, для естественной депонированной формы оксида азота - динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ) - в единичных отечественных и зарубежных публикациях описаны антиокси-дантные свойства [5,9,10], однако их механизм раскрыт недостаточно полно. В частности, в диссертационной работе С.А. Губкиной [10] показано, что тиолсодержащие ДНКЖ способствуют элиминации субстратов карбонильного стресса из модельной среды, что подтверждено данными эксперимента на крысах. Для некото-
Сокращения: ДНКЖ - динитрозильные комплексы железа, МДА - малоновый диальдегид.
рых модельных биосистем эти результаты доказаны и в публикациях К .В. Шумаева с соавт., в которых антиоксидантная активность ДНКЖ проиллюстрирована и в отношении оксидатив-ного и нитрозативного стрессов [5,9,11].
С другой стороны, в настоящее время отсутствуют сведения о сопоставимости и осо-бенностях действия газообразного и депониро -ванного N0 на пар аметры физико-химического гомеостаза крови. В связи с этим нами проведен анализ динамики окислительного метаболизма крови под влиянием оксида азота в газообразном виде и в форме ДНКЖ, что и являлось целью исследования.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Нами проведена оценка действия различных форм N0 на образцы изолированной консервированной крови человека, полученной от практически здоровых доноров (п = 30). Для генерации газообр азного N0 использовали генератор холодной плазмы «Плазон», а также
экспериментальным аппарат для синтеза оксида азота, разработанный в Ро ссийском федеральном ядер ном центре (РФЯЦ). В создаваемом этим аппаратом воздушном потоке, содержащем NO, в отличие от аналогичного потока, создаваемого генератором «Плазон», практически отсутствовала примесь озона и др угих активных фор м кислорода [12]. В качестве депонированной формы NO применяли ДНКЖ с глутатионом, которые синтезировали по методике, разр аботанной P.P. Бородулиным с соавт. в лаборатории А.Ф. Ванина [13].
Для проведения экспериментов каждый образец крови разделяли на пять пор ций по 5 мл, первая из которых являлась контрольной (ин-тактный образец), вторую барботировали газовым потоком от аппарата «Плазон» (средняя мощность, концентрация NO - 800 ррт; V = 100 мл; пр одолжительность обр аботки - 3 мин), третью - тем же потоком, но с концентрацией NO 800 ррт (десятикратное разведение воздухом), четвертую - воздушной газовой смесью от экспериментального NO-генератора [12] (концентрация оксида азота - 75 ррт; объем и продолжительность воздействия аналогичны), пятую - изотоническим водным раствором ДНКЖ (концентрация - 3 ммоль/л, объем -0,05 мл). Концентрация ДНКЖ в растворе была определена спектрофотометрически при длинах волны 310 и 360 нм (спектрофотометр Power-Wave XS, США). Экспозиция после введения NO во всех случаях составляла 5 мин.
В образцах определяли интенсивность про-цессов липопероксидации, общую антиокси-дантную активность плазмы крови и перекис-ную резистентность эритроцитов методом Fe-индуцированной биохемилюминесценции на ап-пар ате Б X Л-06. Уровень малонового диальде-гида (МДА) в плазме крови и эритроцитах оценивали по методу В.Г. Сидоркина и И .А. Чулошниковой (1993) [14]. Супер оксиддисмутаз-ную активность оценивали по методу Т.В. Сироты (1999) [15].
Результаты обрабатывали с использованием программы Statistka 6.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Нами была проведена оценка состояния про- и антиоксидантных систем как в плазме крови, так и в мембранах эр итроцитов. Установлено, что, по параметрам биохемилюминес-ценции (рис. 1), интенсивность процессов ли-попероксидации в плазме крови при ее обработке газовым потоком от аппар ата «Плазон» (концентр ация NO - 800 ррт) существенно увеличивается (на 45%, p < 0,05 относительно
Рис. 1. Влияние оксида азота на интенсивность липопероксидации пламы крови.
интактного образца), что подтверждает ранее полученные нами данные [16]. В случае деся-тикр атного разведения изучаемого газового потока выраженность сдвига светосуммы биохе-милюминесценции плазмы крови снижается, однако последняя остается на достаточно высоких значениях (+27% по сравнению с интактным образцом, р < 0,05).
И спользование экспериментального аппара -та для генерации N0, разработанного в РФЯЦ и создающего воздушную смесь с концентрацией соединения 75 ррт, что сопоставимо по количеству вводимого в биологическую жидкость оксида азота с десятикратным разведением газового потока от «Плазона» (80 ррт), обуславливает менее существенную активацию перекисного окисления липидов по сравнению с описанными ранее воздействиями. Показатель светосуммы хемилюминесценции в данном случае остается выше уровня контрольного образца (р < 0,05 относительно образцов, обработанных исходным и разведенным потоком от аппарата «Плазон», и интактной пор ции крови).
Введение в кровь 0,05 мл водного раствора ДНКЖ, как донора N0, сопоставимо с количеством N0, попадающим в биологическую жидкость при воздействии разведенного газового потока от аппарата «Плазон» и экспериментального N0-генеpатоpа (по 9, 8 и 7,5 мкг оксида азота соответственно). Установлено, что применение ДНКЖ в указанной дозе, в отличие от них, приводит к умеренному снижению интенсивности процессов перекисного окисления
Рис. 2. Влияние оксида азота на общую антиок-сидантную активность плазмы крови.
липидов (на 7%, р < 0,1 по отношению к контролю).
Эта динамика пр ослеживалась и для общей антиоксидантной активности плазмы крови (рис. 2). Так, барботаж биожидкости исходным потоком «Плазона» уменьшает рассматриваемый параметр более чем в два раза относительно контрольного образца (р < 0,05), а его десятикратное разведение снижает уровень ан-тиоксидантных резервов плазмы крови на 21% (р < 0,05). В то же время обработка крови газовым потоком от экспериментального N0-генератора и введение в нее раствора ДНКЖ не изменяли антиоксидантный потенциал био-ср еды.
Оценка уровня МДА, одного из стабильных продуктов липопероксидации, в плазме крови образцов позволила подтвердить выявленные на основе биохемилюминесцентного анализа тенденции (рис. 3). Показано, что барботаж биологической жидкости газовым потоком с 800 ррт N0 приводит к нар астанию значения показателя в 2,3 раза (р < 0,05 по сравнению с интактным образцом), а попытка уменьшить негативное действие данного потока разведением лишь умеренно снижает выраженность эффекта (нар астание концентр ации МДА в 1,9 раза по отношению к контролю, р < 0,05). Напротив, обработка крови практически аналогичным количеством оксида азота при действии воздушной смеси от экспериментального N0-генеpатоpа (75 против 80 ррт) способствует существенно меньшему градиенту уровня метаболита (увеличение в 1,6 раза, р < 0,05).
Рис. 3. Уровень малонового диальдегида плазмы крови при действии свободного и депонированного оксида азота.
Интересная динамика концентрации МДА была зарегистрирована в отношении ДНКЖ. Установлено, что в этом случае значение показателя снижается на 13% относительно уровня интактного образца (р < 0,05), что косвенно может указывать на антиоксидантные свойства соединения.
Сопоставимые изменения претерпевает баланс про- и антиоксидантных систем в эритроцитах (р ис. 4-6). В частности, ур овень пер е-кисной резистентности эритр оцитов при действии исходного потока от аппарата «Плазон» возра стает в 1,36 р аза относительно контрольного образца (р < 0,05). Это свидетельствует о снижении устойчивости мембран изучаемых клеток крови к окислительным воздействиям (отображение мембранодеструктивного действия фактора) и выраженной стимуляции про -цессов липопероксидации в них (рис. 4). Этот эффект существенно нивелируется пр и снижении концентр ации оксида азота в газовом потоке путем его разведения атмосферным воздухом
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.