РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, ТОМ 3(12), № 3-4, с. 235-245
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ИММУНОГЕННОСТИ ТРАНСГЕННОЙ МОРКОВИ, ПРОДУЦИРУЮЩЕЙ S ИЛИ М АНТИГЕНЫ ВИРУСА ГЕПАТИТА В, ПРИ ОРАЛЬНОЙ ИММУНИЗАЦИИ МЫШЕЙ
© 2009 г. С. Н. Щелкунов, А. Е. Нестеров*, С. Г. Поздняков, Г. А. Щелкунова*, А. А. Загорская**, Е. А. Филиппенко**, Н. В. Пермякова**, Л. Д. Позднякова, В. В. Власов, В. К. Шумный**, Е. В.Дейнеко**
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия;
* Федеральное государственное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Кольцово, Новосибирская область, Россия;
** Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия
Поступила: 16.02.2009. Принята: 05.08.2009
Для оральной иммунизации мышей линии БЛЬБ/е использовали сырые корнеплоды трансгенной моркови, продуцирующей Б (ИБвЛд) или М (ргеБ2-ИБ8Лд) антигены вируса гепатита В. Иммунизацию кормлением проводили трехкратно с интервалами в 2 недели между каждым кормлением. При анализе мононуклеарных клеток периферической крови мышей с 14-го дня эксперимента выявлено формирование эффективного ИБвЛд специфичного Т-клеточного иммунного ответа у всех животных, поедавших трансгенную морковь, продуцирующую как Б, так и М антиген вируса гепатита В. При этом антитела против ИБвЛд в плазме крови обнаружены лишь у 11% мышей при иммунизации морковью с Б антигеном и не выявлены для моркови, продуцирующей М антиген. В кишечнике экспериментальных животных обнаружено появление антител против ИБвЛд в группах, получавших Б антиген (28% животных) и М антиген (11%). Ни в одном из образцов крови или кишечника контрольных животных, поедавших исходную морковь или морковь со встройкой векторной Т-ДНК, антител против ИБвЛд обнаружено не было.
Ключевые слова: съедобная вакцина, вирус гепатита В, трансгенные растения, морковь
ВВЕДЕНИЕ
Большинство инфекционных агентов проникает в организм человека через слизистые оболочки и поэтому защитные функции слизистых выполняют роль первого барьера на пути развития таких инфекций. Данные защитные функции обеспечиваются в значительной степени наличием в слизистых тканях многочисленных иммунокомпетентных клеток, в том числе Т и В лимфоцитов. Эти клетки организованы в мукозально ассоциированные лимфоидные ткани, являющиеся основными компонентами мукозальной иммунной системы, которая отличается по функциям от системного иммунного ответа, обеспечивающего защиту внутренних органов.
Адрес: 630559, Новосибирская обл., п. Кольцово, ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор". E-mail: snshchel@vector.nsc.ru
Многочисленные исследования показали, что индукция системного иммунитета в результате инъекционной иммунизации может эффективно предотвращать развитие инфекционного процесса, но обычно при этом не защищает слизистые оболочки. Мукозальная иммунизация (доставка антигена на слизистые поверхности) чаще всего приводит к стимуляции как мукозального, так и системного иммунных ответов [1]. Таким образом, для эффективной защиты слизистых оболочек необходимо осуществлять мукозальную иммунизацию.
Важно отметить факт взаимосвязи мукозального иммунного ответа слизистых оболочек желудочно-кишечного, респираторного и генитального трактов. Так, если стимулировать иммунный ответ в кишечнике, то специфичный иммунный ответ против данного антигена будет наблюдаться в респираторном и генитальном трактах [1, 2].
Гепатит В является одной из глобальных проблем здравоохранения. Примерно 2 млрд. человек в мире были инфицированы вирусом гепатита В (ВГВ) [2, 3]. Часть из них остается хроническими носителями ВГВ, численность которых в настоящее время составляет около 350 млн. человек. У хронических носителей ВГВ риск развития гепатоцеллюлярной карциномы в 100 — 200 раз выше по сравнению с неинфицированными людьми [3, 4]. Число смертей, обусловленных ВГВ, оценивается величиной около 1 млн человек ежегодно [5].
Образование поверхностных вирионных белков ВГВ контролируется одним вирусным геном env, имеющим три стартовых кодона. Поэтому оболочка вириона ВГВ собирается из трех белков — короткого Б (ИБвЛд), среднего М (рге82-ИБ8Лд) и большого Црге81-рге82-ИБ8Лд) [2]. ИБвЛд является гликопротеином, который присутствует в зараженном организме не только в составе вирионов диаметром 42 нм, но и в виде сферических частиц диаметром 18 — 22 нм, образующихся в результате самосборки молекул ИБвЛд. Данные частицы Б антигена, очищенные от других компонентов вируса, высокоиммуногенны и защищают человека от последующей вирусной инфекции [6].
Первая вакцина против гепатита В была предложена в 1981 г. и представляла собой препарат мультисубъединичных частиц ИБвЛд, очищенных из плазмы донорской крови хронически инфицированных ВГВ людей. Данная вакцина была дорогая и малодоступная для вакцинации [3, 7]. Современная вакцина против гепатита В представляет собой ИБвЛд, производимый в рекомбинантных дрожжах. Курс из трех инъекций обеспечивает защиту более 95% младенцев и 90% взрослых [2]. Однако имеется несколько факторов, ограничивающих успешное применение данной вакцины в глобальном масштабе. Во-первых, стоимость вакцины по-прежнему высока для развивающихся стран. Во-вторых, инъекционное введение по определенной схеме требует наличия достаточно многочисленного обученного персонала. В-третьих, небольшая, но существенная часть вакцинируемых не защищается от ВГВ. Все это указывает на необходимость разработки новых вариантов вакцины против гепатита В, которые были бы эффективны, дешевы, безопасны и просты в использовании. Мукозальная вакцина может явиться такой альтернативой.
Новейший подход к созданию мукозальных вакцин состоит в получении трансгенных
растений, продуцирующих протективные антигенные белки инфекционных агентов, и использование их в качестве съедобных вакцин [8—10]. Стенки клеток растений обеспечивают эффективную защиту находящегося в них антигена после поедания и прохождения через желудок. Поэтому так «упакованный» антиген эффективно достигает кишечника, в котором и представляется мукозальной иммунной системе. Важной особенностью таких съедобных вакцин является их потенциальная дешевизна. По выполненным оценкам рекомбинантные белки, синтезированные в трансгенных растениях, заметно дешевле по сравнению с этими же белками, произведенными в других генноинженерных системах, включая дрожжевую и бактериальную [11]. В случае использования трансгенных растений в качестве съедобных вакцин не требуется выделения и очистки целевого белка, что дополнительно значительно снижает стоимость иммуногенного препарата. Другими привлекательными свойствами съедобных вакцин на основе трансгенных растений являются их биологическая безопасность (отсутствие в растениях вирусных патогенов человека), простота хранения (не требуется холодовая цепь) и применения (безыгольная иммунизация).
Обнаружено, что антитела против синтетических пептидов ргеБ2 способны нейтрализовать ВГВ [12, 13]. Поэтому полагают, что вакцина на основе М (ргеБ2-8) антигена может быть более иммуногенна по сравнению с классической на основе Б антигена и предпринимаются попытки создания вакцин против гепатита В на основе М антигена [14, 15]. При этом пока не проведено сравнения иммуногенных свойств Б и М антигенов ВГВ при оральном применении в составе съедобных вакцин.
Целью настоящей работы явилось создание трансгенных растений моркови, продуцирующих Б или М антиген ВГВ, и сравнительное изучение их иммуногенности при кормлении мышей сырыми корнеплодами этих растений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Генетическая трансформация растений моркови
Для получения трансгенных растений моркови использовали ночную культуру А. tumefa-ciens, штамм ЬБЛ4404 (№ 1022 из коллекции Центра «Биоинженерия» РАН, г. Москва) с
кодирующими последовательностями Б или М ВГВ, встроенные под контроль промотора 35Б вируса мозаики цветной капусты в составе бинарного вектора pBINPLUS/ARS [16]. Для трансформации использовали 10-ти недельные каллусные культуры моркови сорта Нантская-4.
Трансформацию моркови проводили методом совместного культивирования каллус-ных культур, индуцированных из семядолей зародышей предварительно набухших семян, с ночной культурой А. tumefaciens [17]. Для трансформации использовали каллус, культивируемый в течение 10-ти недель. Отдельные кусочки каллусов помещали на среду МС (МигавЫде а^ Бкооде, 1964) с добавлением 0,2 мг/л кинетина. На поверхность каждого каллуса наносили по 0,1 мкл ночной культуры А. tumefaciens и культивировали совместно в течение трех суток в темноте. После кокультивирования каллусы переносили на свежую среду того же состава с добавлением антибиотиков (500 мг/л цефотаксима и 200 мг/л канамицина) для подавления роста агробактерии и проведения селективного отбора трансформированных клеток. Селективный отбор проводили в течение 8 недель. Культивирование проводили при температуре +22 оС и освещенности 2 тыс. люкс.
Получение растений-регенерантов
Для получения растений-регенерантов каллусы переносили на среду МБ [18] с добавлением 0.1 мг/л кинетина и 100 мг/л канамицина. Растения-регенеранты для укоренения переносили в пробирки на мостики из фильтровальной бумаги, помещенные в жидкую среду МБ с добавлением 100 мг/л канамицина в качестве селективного агента. Растения-регенеранты с хорошо сформированной корневой системой переносили в пластиковые сосуды по 4 — 5 растений и после 3 — 4 недель проводили подготовительную процедуру адаптации растений к условиям открытого грунта в теплице. Подготовка растений состояла в кратковременном открывании сосудов на небольшой промежуток времени, начиная с 5 мин с постепенным увеличением от нескольких часов до полного выращивания растений в сосудах с удаленными крышками. Данная стадия необходима для минимизации потерь растений-регенерантов при их переносе в открытый грунт теплицы.
Получение корнеплодов у растений-регене-рантов
Хорошо сформированные растения моркови с развитой корневой системой переносили в индивидуальные сосуды объемом 200 мл, заполненные субстратом (смесь мелкой фракции керамзита и вермикулита в соотнош
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.