БИОЛОГИЯ МОРЯ, 2004, том 30, № 4, с. 289-295
УДК 575.832:597.553.2 МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ИЗМЕНЧИВОСТИ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК У КОРЮШКОВЫХ РЫБ1
© 2004 г. Л. А. Скурихина, А. Г. Олейник, М. В. Панькова
Институт биологии моря ДВО РАН, Владивосток 690041 e-mail: inmarbio@mail.primorye.ru
Статья принята к печати 26.11.2003 г.
У пяти видов корюшковых рыб семейства Osmeridae с использованием рестрикционного анализа (RFLP) исследован участок митохондриальной ДНК, кодирующий ND5/ND6 субъединицы надоксиддегидрогеназы, ам-плифицированный в полимеразной цепной реакции (PCR). Уровень дивергенции нуклеотидных последовательностей митохондриальной ДНК между видами лежит в пределах от 11.9 (Hypomesus nipponensis и H. japonicus) до 24.7% (Osmerus mordax dentex и Mallotus villosus catervarius). При этом уровень генетической дивергенции между популяциями H. nipponensis составляет 0.32%, H. japonicus - от 0.08 до 0.15%, Osmerus mordax dentex -0.025%. Отсутствие общих гаплотипов позволяет дифференцировать близкородственные виды корюшек, что может помочь при решении спорных вопросов систематики и биогеографии данного семейства рыб.
Ключевые слова: Osmeridae, митохондриальная ДНК, рестрикционный анализ (RFLP), полимеразная цепная реакция (PCR), генетическая дивергенция.
Comparative PCR-RFLP-analysis of the mitochondrial DNA variation in smelts (Osmeridae). L. A. Skurik-hina, A. G. Oleinik, M. V. Pankova (Institute of Marine Biology, Far East Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690041)
The mtDNA region coding for ND5/ND6 subunits of NADH-dehydrogenase mitochondrial DNA amplified in the polymerase chain reaction (PCR) was studied, using the analysis of restriction fragment length polymorphism (RFLP), in five species of smelts (the family Osmeridae). The divergence of mtDNA nucleotide sequences between the species was in the range from 11.9 (Hypomesus nipponensis and H. japonicus) to 24.7% (Osmerus mordax dentex and Mallotus villosus catervarius). The level of genetic divergence between populations was 0.32% for H. nipponensis, 0.08 to 0.15% for H. japonicus, and 0.025% for Osmerus mordax dentex. The absence of common haplotypes allows one to differentiate between closely related species of smelts, which can be helpful in solving problems of systematics and biogeography of the Osmeridae. (Biologiya Morya, Vladivostok, 2004, vol. 30, no. 4, pp. 289-295).
Key words: Osmeridae, mitochondrial DNA, restriction endonuclease analysis (RFLP), polymerase chain reaction (PCR), genetic divergence.
В водоемах азиатского побережья и в прибрежных водах северо-западной части Тихого океана обитают представители наиболее массовых родов семейства Osmeridae - Osmerus, Hypomesus и Mallotus, включающих морские, проходные и жилые формы (Берг, 1948; McAllister, 1963; Клюканов, 1977; Nelson, 1994; Череш-нев, 1996; Johnson, Patterson, 1996; Решетников и др., 1997; Соколовская и др., 1998; Соколовский, Оксюзьян, 2001; Федоров и др., 2003). Если систематика родов Osmerus и Mallotus не вызывает у исследователей особых разногласий, то таксономические отношения и биогеография рода Hypomesus вновь и вновь обсуждаются и уточняются (Hamada, 1954, 1957, 1961; McAllister, 1963; Клюканов, 1966, 1970, 1975; Гриценко, Чуриков, 1983; Чуриков, Карпенко, 1987; Saruwatary et al., 1997; Черешнев и др., 1999, 2001).
Известно, что в последнее время для решения многих таксономических проблем и проверки различных гипотез привлекаются молекулярно-генетические исследования. При этом большого внимания заслуживает изучение митохондриального генома организмов, который наследуется по материнской линии без реком-
бинаторной изменчивости и обладает более высокой скоростью нуклеотидных замен, чем ядерный геном (Brown et al., 1979). Это позволяет наиболее точно проводить дифференциацию близкородственных таксонов.
В данной работе нами предпринята попытка исследовать изменчивость митохондриальной ДНК (мтДНК) у пяти видов корюшковых рыб, входящих в состав названных выше родов семейства Osmeridae.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Материалом послужили препараты ДНК от 120 рыб, собранных в весенне-летний период 2001 г. (табл. 1). Видовая принадлежность на основе морфологических признаков установлена И.А. Черешневым.
Индивидуальные препараты тотальной ДНК получали из фиксированных тканей печени и сердца по стандартной методике (Sambrook et al., 1989). Изменчивость мтДНК анализировали, используя рестрикционный анализ (RFLP) участка ND5/ND6, кодирующего две субъединицы надоксиддегид-рогиназы, амплифицировав его в полимеразной цепной реакции (PCR). Протяженность этого участка составляет 2488 пар оснований, его положение на карте мтДНК, праймерные последовательности и условия амплификации приведены в работе Гаретта с соавторами (Gharrett et al., 2001).
'Исследование осуществлено при финансовой поддержке грантов РФФИ и РФФИ-Приморье (№ 01-04-49436 и 01-04-96926).
Таблица 1. Исследованные виды и популяции корюшковых рыб семейства Osmeridae
Вид
Популяиця
Объем выборки, экз.
Hypomesus japonicus (Brevoort, 1856)
H. japonicus (Brevoort, 1856)
H. japonicus (Brevoort, 1856)
H. nipponensis McAllister, 1963
H. nipponensis McAllister, 1963
H. olidus (Pallas, 1814)
Mallotus villosus catervarius (Pennat, 1784)
Osmerus mordax dentex, Steindachner, 1870
O. mordax dentex, Steindachner, 1870
Амурский залив (сев.-зап. часть зал. Петра Великого Японского моря) б. Ольга (сев.-зап. часть Японского моря) б. Экспедиции (зал. Посьет, юго-зап. часть зал. Петра Великого Японского моря) р. Серебрянка (сев.-зап. часть Японского моря) б. Ольга
р. Самарга (юго-зап. часть Татарского пролива) б. Нагаева (сев. часть Охотского моря) б. Ольга
р. Максимовка (сев.-зап. часть Японского моря)
10
15
18
15 8 6 12 18 18
Номер*
1
2
3
4
5
6
7
8
9
*Соответствует нумерации популяций в табл. 2-4.
Амплифицированный фрагмент анализировали набором из 11 рестрикционных ферментов в условиях, рекомендованных изготовителем ("MBI Fermentas", Lithuania; "СибЭнзим", Россия): AsuI (G'GNCC), Avail (G'GWCC), BstNI (CC'WGG), BstUI (CG'CG), EcoRV (GAT'ATC), Hinii (G'ANTC), MboI ('GATC), MspI (C'CGG), Rsal (GT'AC), Styl (C'CWWGG), TagI (TC'GA). Продукты рестрикции разделяли в 1.5-2% агароз-ном геле, содержащем одну часть Ultra Pure™ agarose ("BRL Gibco", Grand N.Y.) и две части Synergel™ (Diversified Biotech Inc., Boston MA) в 0.5-кратном трис-боратном буфере (Sambrook et al., 1989). Фрагменты ДНК в геле окрашивали этидиумбромидом и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете. В качестве молекулярных маркеров длины использовали фрагменты ДНК фагов X и фХ174, гидролизо-ванные рестриктазами PstI и HiniI соответственно, а также набор фрагментов ДНК, кратных 100 парам оснований ("BRL Gibco", Grand N.Y.).
Гетерогенность между выборками определяли с использованием метода Монте-Карло в пакете программ REAP (McElroy et al., 1992). Количество замен оснований на нуклео-тидный сайт (d), их стандартное отклонение, величину дивергенции между выборками (8), а также нуклеотидную (п) и га-плотипическую (h) величины разнообразия рассчитывали в пакете программ REAP (McElroy et al., 1992). Статистическая обработка полученных результатов включала фенетический анализ признаков методом невзвешенной парно-групповой средней связи (UPGMA) с использованием программы NTSYS (Rohlf, 1990).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
У 120 исследованных нами корюшек выявлено 39 гаплотипов мтДНК: у Hypomesus japonicus - 20, у H. nipponensis - 6, у H. olidus - 1, у Mallotus villosus catervarius - 6, у Osmerus mordax dentex - 6 (табл. 2). Эти гаплотипы отличаются во всех анализируемых таксономических группах.
Анализ географической гетерогенности частот гаплотипов методом Монте-Карло (McElroy et al., 1992) выявил статистически значимые различия между двумя исследованными популяциями H. nipponensis (X = = 23.00, Р << 0.001), а также между тремя популяциями H. japonicus (X2 = 51.50, Р = 0.01). Различия между популяциями O. mordax dentex оказались недостоверными (X2 = 6.00, Р = 0.3463). Рассчитаны также значения %2
между объединенными выборками H. japonicus, H. nipponensis, H. olidus, M. villosus catervarius и O. mordax dentex. Различия между видами оказались высокодостоверными (Р << 0.001).
Средние значения разнообразия гаплотипов и уровень нуклеотидной изменчивости в популяциях H. japonicus (0.9231 ± 0.0560 и 0.01689 соответственно) оказались выше, чем в популяциях H. nipponensis (0.5845 ± 0.1262 и 0.0262) и O. mordax dentex (0.3105 ± ± 0.1346 и 0.0010) (табл. 3). Поскольку из р. Самарга исследовано небольшое число особей H. olidus, полученные оценки, вероятно, не отражают реальный уровень гаплотипического и нуклеотидного разнообразия данного вида.
Значения внутри- и межвидовой дивергенции для анализируемых таксонов (Nei, Tajima, 1981; Nei, Miller, 1990), выраженные в процентах нуклеотидных замен на рестрикционный сайт, определены с учетом относительных частот гаплотипов в популяциях (табл. 4). Величина дивергенции нуклеотидных последовательностей мтДНК между H. nipponensis и H. japonicus составила около 11.9%, H. nipponinsis и H. olidus - 14.1%, H. japonicus и H. olidus - 18.1%. Уровень дивергенции мтДНК между родами Hypomesus и Osmerus равнялся 17.9%, Hypomesus и Mallotus - 18.0%, Osmerus и Mallotus - 24.7%. При этом уровень генетической дивергенции между популяциями H. nipponensis составлял 0.32%, H. japonicus - от 0.08 до 0.15%, O. mordax dentex - 0.025%. Таким образом, уровень внутривидовой изменчивости мтДНК для всех исследованных таксонов не превышал 1%.
На основе полученных оценок построена фено-грамма с использованием метода невзвешенной парно-групповой средней связи (UPGMA) (см. рисунок). Исследованные популяции H. nipponensis образовали компактную группу, к которой присоединяется кластер, объединяющий популяции H. japonicus. Далее к этому кластеру последовательно присоединяются ветви H. olidus, O. mordax dentex и наиболее дивергировавшей от них M. villosus catervarius.
Следует отметить, что работ по корюшковым рыбам, выпо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.