научная статья по теме СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЛЬДООБРАЗУЮЩИХ СВОЙСТВ КЛЕТОК И ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ БАКТЕРИЙ РОДА PSEUDOMONAS Биология

Текст научной статьи на тему «СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЛЬДООБРАЗУЮЩИХ СВОЙСТВ КЛЕТОК И ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ БАКТЕРИЙ РОДА PSEUDOMONAS»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 4, с. 504-510

= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 579.841.11.013:577.114.7

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЛЬДООБРАЗУЮЩИХ СВОЙСТВ КЛЕТОК И ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ БАКТЕРИЙ РОДА PSEUDOMONAS

© 2004 г. Г. М. Здоровенко*, С. Н. Веремейченко**, Е. А. Киприанова*

*Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного HAH Украины, Киев **Научно-производственная компания "Диапроф-Мед", Киев Поступила в редакцию 31.03.03 г.

Охарактеризованы льдообразующие свойства микробных клеток штаммов Pseudomonas fluorescens, P. syringae, P. fragi, P. pseudoalcaligenes и полученных из них препаратов экзоцеллюлярных липопо-лисахаридов (ЭЛПС), экскретируемых микробной клеткой в окружающую среду; липополисахари-дов (ЛПС) и отдельных структурных частей макромолекулы ЛПС: липида А, корового олигосаха-рида и О-специфического полисахарида (ОПС). Нативные микробные клетки штаммов P. syringae ИМВ 1951 и ИМВ 185 обладали льдообразующими свойствами (начало льдообразования при -1 и -4°C соответственно). Клетки штаммов P. fluorescens ИМВ 1433 и ИМВ 2125 понижали температуру замерзания суспензии, т.е. обладали антифризными свойствами. Не выявлено выраженной зависимости характера и степени льдообразующей активности от таксономической принадлежности штамма: активность препаратов ЭЛПС мало зависела от концентрации вещества в диапазоне концентраций 0.2-0.4%. Льдообразующие свойства препаратов ЭЛПС, ЛПС и структурных частей макромолекулы ЛПС в большинстве случаев отличались от активности соответствующих нативных микробных клеток. По-видимому, эти биополимеры не играют определяющей роли в процессе инициации льдообразования, однако оказывают влияние на характер протекания этого процесса. Выявлены некоторые взаимосвязи между строением ЛПС и характером его воздействия на процесс льдообразования.

Ключевые слова: P. fluorescens, P. syringae, P. fragi, P. pseudoalcaligenes, липополисахариды, льдообразующие, антифризные свойства.

Наличие на поверхности растений центров (ядер) кристаллизации льда играет основную роль в поражении их морозом [1]. Такие центры препятствуют переохлаждению воды, чем значительно повышают температуру ее замерзания. Наиболее активными инициаторами процесса льдообразования являются бактерии, обитающие на поверхности растений. В частности, установлена высокая льдообразующая активность фитопа-тогенных бактерий Pseudomonas syringae, Erwinia herbicola, представителей рода Xanthomonas, а также некоторых представителей сапрофитных видов родов P. и Comamonas [1, 2]. Проблема льдообразования представляет значительный практический интерес в плане защиты растений от заморозков, разработки реагентов для воздействия на облака [3]. Льдообразующие штаммы P. fluorescens, попадая в кишечник колорадского жука, вызывают гибель этих морозочувствитель-ных насекомых, что может существенно понизить их выживаемость зимой [4], и тем самым снизить потери урожая. Усилия ученых направлены как на исследование распространенности свойства льдообразования у различных представителей микробного мира [1, 3], так и на выясне-

ние природы структур микробной клетки, определяющих льдообразующую активность [5-8].

Строение и макромолекулярная организация биополимеров, ответственных за льдообразование, пока изучены недостаточно. Известно [8], что существует 3 класса структур, участвующих в процессе льдообразования: протеин, связанный с фосфатидилинозитом (класс А); протеин, связанный с маннаном и глюкозамином (класс В) и протеин, связанный с единичными маннозными остатками (класс С). Установлено, что способность бактерий инициировать льдообразование определяется белковыми продуктами специфических генов: та2 для Р. syringae, inaW для Р. fluorescens и кеЕ для Е. НегЫсо1а. Наиболее активная структура содержит белок, к которому присоединен фос-фатидилинозит и манноза, возможно как полимер маннана или глюкозамина [6-8]. Таким образом, максимальная льдообразующая активность проявляется комплексными структурами, одним из компонентов которых являются углеводы.

Одной из основных структур клеточной оболочки грамотрицательных бактерий является ли-пополисахарид (ЛПС), молекула которого включает гидрофильный углеводный домен, содержащий О-специфический полисахарид (ОПС) и

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЛЬДООБРАЗУЮЩИХ СВОЙСТВ КЛЕТОК

505

коровый олигосахарид. Последний ковалентно присоединяется к гидрофобной части ЛПС - ли-пиду А, который служит связывающим звеном между углеводным доменом и внешней мембраной. Молекулы ЛПС образуют комплексы с на-ружномембранными протеинами и, находясь в наружном монослое клеточной мембраны, непосредственно контактируют с окружающей средой. Более того, эти биополимеры экскретируются микробной клеткой прижизненно и после гибели клетки в окружающую среду [9]. К настоящему времени накоплено множество данных по строению и биологическим свойствам ЛПС различных видов грамотрицательных бактерий, но ничего неизвестно об их возможной роли как катализаторов процесса льдообразования.

В последние годы мы проводим систематические исследования строения и биологических свойств ЛПС бактерий Pseudomonas fluorescens гомологии-группы [10].

Целью настоящей работы было исследовать льдообразующую активность нативных микробных клеток ряда штаммов видов P. syringae, P. flu-orescens, P. fragi, P. pseudoalcaligenes, а также ЭЛПС и ЛПС препаратов, выделенных из некоторых штаммов этих бактерий. Изучить льдообразующую активность отдельных структурных частей макромолекулы ЛПС, проанализировать возможную взаимосвязь между строением ЛПС и характером его влияния на процесс льдообразования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования были 16 штаммов, представляющих различные виды рода Pseudomonas (P. fluorescens, P. syringae, P. fragi, P. pseudoal-caligenes), полученные из Украинской коллекции микроорганизмов (УКМ), поддерживаемой в Институте микробиологии и вирусологии им. Д.К. За-болотного НАН Украины, а также препараты ЭЛПС и ЛПС и отдельных структурных частей макромолекулы ЛПС этих штаммов.

Бактерии выращивали при 28°C на мясопептон-ном агаре (МПА) в течение 28 ч либо картофельном агаре (КА) при 26-28°C (штаммы P. syringae). Для выделения ЛПС бактериальную массу смывали физиологическим раствором, суспензию центрифугировали в течении 30 мин при 10000 g, отмывали физиологическим раствором, сушили ацетоном и диэтиловым эфиром. ЛПС из сухой бактериальной массы выделяли фенол-водной экстракцией по методу Вестфаля, очищали трехкратным ультрацентрифугированием при 105000 g. Осадок сушили лиофильно. Для штаммов P. syringae ЛПС в виде ЛПС-белкового комплекса вымывали из сырых микробных клеток 0.85% раствором NaCl, как описано в работе [11]. Препараты

ЭЛПС, ЛПС, липида А, корового олигосахарида, ОПС получали, как описано в работах [9, 10]. Общее содержание углеводов, количество белка, уровень фосфорилирования препаратов ЛПС, а также содержание липидного компонента, жирных кислот и компонентов гидрофильной части липида А определяли, как описано в работе [10]. Льдообразующую активность микробных клеток и выделенных из них препаратов определяли с использованием камеры "Селена" по методике [2] и представляли в виде доли (%) замерзших капель (Л/Л0, %, где N - число незамерзших капель, Л0 - общее число капель).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для возможности сравнительного анализа данных, льдообразующие свойства нативных микробных клеток и ЛПС препаратов из них, включая препараты составных частей макромолекулы ЛПС, были определены в идентичных условиях. В качестве контроля использовали бидистилли-рованную воду, капли которой начинали замерзать при температуре -9°С. Замерзание водных суспензий бактерий выше этой температуры может быть отнесено за счет льдообразующей активности испытуемых препаратов. Как видно из приведенных результатов сравнительного исследования (табл. 1), интактные микробные клетки большинства изученных штаммов бактерий оказывали влияние на процесс льдообразования, но обладали низкой льдообразующей активностью. Штаммы различались по температуре начала инициации их клетками процесса льдообразования и по активности его нарастания. При этом выявлены штаммы (Р. Аиогв8свт ИМВ 1433 и ИМВ 2125, водные суспензии клеток которых замерзали при температуре более низкой, чем температура замерзания бидистиллированной воды (на 3°С ниже), т.е. клетки этих штаммов обладали анти-фризными свойствами. Препараты клеток штаммов Р. syringae ру. аргага ИМВ 185 и Р. fluorescens ИМВ 472 (биовар I) обладали слабой льдообразующей активностью. Исключительно высокой льдообразующей активностью при стремительном ее нарастании характеризовался штамм Р. 8у-ringae ру. syringae (НоШ) ИМВ 1951. Корреляция между уровнем льдообразующей активности и таксономическим рангом исследуемых штаммов не прослеживается. То, что именно для штаммов, представляющих фитопатогенный вид Р. syringae, выявлен самый высокий уровень льдообразующей активности (ИМВ 185 и ИМВ 1951) коррелирует с данными литературы, согласно которым основная часть центров льдообразования биогенного происхождения связана с бактериями, обитающими на листьях растений [12]. Процесс замерзания суспензий интактных микробных клеток в отдельных случаях имел ступенчатый характер (табл. 1). Это согласуется с предположением, что

Таблица 1. Льдообразующая активность нативных микробных клеток штаммов различных видов бактерий рода Pseudomonas

Штаммы

Динамика замерзания капель в камере "Селена" при понижении t от -1 до - 19°С, % замерзших капель

-1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10 -11 -12 -13 -14 -15 -16 -17 -18 -19

P. fluorescens ИМВ 4125 (биовар I) 2 4 6 12 40 64 80 100

P. fluorescens ИМВ 1433 (биовар I) 2 12 22 64 72 90 100

P. fluorescens ИМВ 1152 (биовар I) 2 8 14 18 20 30 64 80 92 100

P. fluorescens ИМВ 247 (биовар II) 2 6 6 8 8 22 42 86 94 100

P. fluorescens ИМВ 472 (биовар I) 2 8 78 100

P. fluorescens ИМВ 1602 (биовар II) 4 4 4 6 8 16 28 38 64 86 100

P. fluorescens ИМВ 2125 (биовар III) 2 14 30 80 100

P. fluorescens ИМВ 2303 (биовар I) 2 8 8 8 12 20 30

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком