МИКРОБИОЛОГИЯ, 2012, том 81, № 5, с. 600-610
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.222
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ N-КОНЦА МЕТАКРИЛАТРЕДУКТАЗЫ БАКТЕРИИ GEOBACTER SULFURREDUCENS AM-1 © 2012 г. О. В. Архипова*, ^ Г. В. Микулинская**, А. С. Галушко***
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук, Пущино
** Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Пущино ***Венский университет, Вена, Австрия Поступила в редакцию 20.11.2011 г.
Сравнительный анализ аминокислотной последовательности N-конца метакрилатредуктазы (50 кДа) анаэробной бактерии Geobacter sulfurreducens AM-1 выявил ее значительное сходство с участками фла-воцитохромов с и флавинсодержащих белков у бактериальных анаэробных представителей родов Anaeromyxobacter, Campylobacter, Desulfatibacillum, Desulfuromonas, Geobacter, Parasutterella, Shewanella, Sulfurospirillum, Sutterella, Wolinella, относящихся к четырем классам отдела Proteobacteria; Denitrovibrio отдела Deferribacteres; Desulfitobacterium отдела Firmicutes; Eggerthella и Slackia отдела Actinobacteria; Spi-rochaeta отдела Spirochaetes. Кроме того, высокая гомология была обнаружена между аминокислотной последовательностью метакрилатредуктазы и флавопротеинами аэробных бактерий родов Frankia и Gordonia отдела Actinobacteria и археи Haloterrigena turkmenica отдела Euryarchaeota. В работе подчеркивается, что среди 11 бактерий рода Geobacter с известными геномами только у способного к "хлородыханию" G. lovleyi SZ был обнаружен аминокислотный фрагмент флавоцитохрома с, обладающий выраженным сходством (80%) с N-концом метакрилатредуктазы. Рассматриваются общие для обнаруженных бактерий свойства. Анализируются расчетные молекулярные массы, возможные функции и локализация в клетке гомологичных белков. Обсуждается соответствие группирования выявленных протеинов в дендрограмме филогенетической принадлежности их носителей. Высказываются предположения о широте распространения и эволюционной значимости подобных белков для микроорганизмов.
Ключевые слова: анаэробное дыхание, метакрилатредуктаза, Geobacter sulfurreducens AM-1, Proteobacteria, N-конец, BLAST, аминокислотная гомология, флавоцитохромы с, флавопротеины.
Интерес к представителям рода Geobacter (8-Proteobacteria) связан с их значимостью в процессах биоремедиации радиоактивных металлов [1—4]. Они играют значительную роль в глобальных круговоротах металлов и углерода: восстанавливают Fe(III) в Fe(II), U(VI) в U(IV), окисляют ацетат или другие органические субстраты, участвуют в разложении гумуса. Кроме того, бактерии рода Geobacter являются электротрофа-ми [5].
G. sulfurreducens АМ-1 был выделен в чистую культуру при установлении путей разложения отходов метакрилатных производств [6]. Штамм АМ-1 полностью окисляет органическое соединение (ацетат) при одновременном восстановлении органического вещества (метакрилата=2-ме-тилпропеноата). При этом соединение антропогенной природы метакрилат служит конечным акцептором редуктазной цепи бактерии: принимает восстановительные эквиваленты от цито-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: aroksan@gmail.com).
плазматического ЦТК через мембраннный мена-хинон с 8-ю изопреноидными остатками в боковой цепи [7]. Было показано, что превращение метакрилата в изобутират катализирует пери-плазматическая флавинсодержащая метакрилатредуктаза с молекулярной массой 50 кДа [7, 8]. Активность метакрилатредуктазы зависит от пе-риплазматического тетрагемового цитохрома с с молекулярной массой 30 кДа, который является физиологическим донором электронов для фермента. "Передаточное звено" от менахинона к цитохрому с (30 кДа) до сих пор не известно. Однако предполагается участие в этом процессе допол-нительного(ых) цитохрома(ов) с. Возможными кандидатами на эту роль являются периплазмати-ческие цитохромы с с молекулярными массами 12.5 и 15.5 кДа и мембранный — с молекулярной массой 67.6 кДа [9].
У выделенной в чистом виде цитохром с-мета-крилат-оксидоредуктазы была определена аминокислотная последовательность Оконца длиной 27 аминокислот, в основном, гидрофобных [7]. В то время (1999 г.) наибольшая аминокислот-
ная гомология обнаружилась для периплазмати-ческого белка FccA (68% сходства) из s-про-теобактерии Wolinella succinogenes. Было высказано предположение, что физиологическая роль белка FccA из W. succinogenes сопряжена с восстановлением метакрилата и акрилата [10]. Спустя несколько лет было обнаружено сходство цито-хром с-метакрилат-оксидоредуктазы (50 кДа) с флавопротеинами разных классов протеобакте-рий [8]. Наибольшая аминокислотная гомология наблюдалась для двух флавопротеинов NP_719167.1 (83% сходства) и NP_717134.1 (75% сходства) у-протеобактерии Shewanella oneidensis.
Интенсивное развитие информационных технологий за последние 5 лет привело к расшифровке генов и геномов множества бактерий. Количество известных полных бактериальных геномов увеличивается с каждым днем с такой скоростью, что аннотирование и опубликование их отстает от установления нуклеотидных последовательностей. К примеру, в базах данных сервера Национального центра биотехнологической информации доступны геномы 11 видов рода Geo-bacter, а в литературе описаны лишь 5 [11—15]. Таким образом, было логичным предполагать, что сравнение известного фрагмента метакрилатре-дуктазы с аминокислотными последовательностями белков, доступными в базах данных, даст новые результаты.
Целью работы был анализ распространения установленного аминокислотного фрагмента уникальной метакрилатредуктазы G. sulfurre-ducens среди представителей разных таксонов, а также функций, локализации, происхождения и соответствия филогенетической принадлежности родственных ей белков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследований служила анаэробная бактерия G. sulfurreducens АМ-1 из коллекции культур Лаборатории анаэробных микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (г. Пущино).
Предметом исследований была аминокислотная последовательность N-конца метакрилатредуктазы бактерии G. sulfurreducens АМ-1, установленная ранее [7].
Все использованные в работе аминокислотные последовательности белков и нуклеотидные последовательности генов ферментов и 16S рРНК доступны в базах данных GenBank, Gene, Genome, Nucleotide, Protein с сервера National Center of Biotechnology Information, National Library of Medicine, USA (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Для сравнительного анализа аминокислотных последовательностей использовали программу PSI-BLAST [16] с сервера NCBI.
Определение наличия пептидной сигнальной последовательности проводили с помощью программы PRED-TAT [17], доступной на сервере Department of Computer Science and Biomedical Informatics, University of Central Greece, Lamia, Greece (http://www.compgen.org).
Филогенетический анализ генов 16S pPHK и гомологичных белков был сделан с помощью программы MEGA 4.0 [18]. Родство сиквенсов анализировали программой CLUSTALW, встроенной в пакет MEGA. Дендрограммы были построены с использованием алгоритма "метод объединения соседей" (Neighbor joining method) и проверены методом "Bootstrap analysis (1000 замещений)".
РЕЗУЛЬТАТЫ
Сравнительный анализ аминокислотной последовательности N-конца метакрилатредуктазы (50 кДа) анаэробной бактерии G. sulfurreducens AM-1 обнаружил выраженное (Е < 10-4) сходство с участками более 200 аминокислотных последовательностей. В таблицу отобраны аминокислотные последовательности, обладающие наибольшим сходством с предметом сравнения. В основном, это флавоцитохромы с и флавинсодержащие сукцинатдегидрогеназы и фумаратредуктазы анаэробных и аэробных представителей домена Bacteria, относящихся: к 4 классам отдела Proteobacteria (10 родов), классу Actinobacteria отдела Actinobac-teria (4 рода), отделу Deferribacteres (Denitrovibrio), отделу Firmicutes (Desulfitobacterium), отделу Spiro-chaetes (Spirochaeta), и аэробного представителя домена Archaea, относящегося к отделу Eury-archaeota (Haloterrigena turkmenica) (таблица). В случае, когда у представителя одного из видов бактерий, приведенных в таблице, имеется целый ряд схожих белков (что, например, характерно для геномов Parasutterella excrementihominis YIT 11859, Sutterella wadsworthensis 3_1_45B), в таблице приведена одна последовательность, а общее их количество можно оценить, взглянув на графу 6 (Наличие дополнительных сходных последовательностей в геноме).
Как следует из таблицы, подавляющее большинство обнаруженных белковых последовательностей имеют длину порядка 510—520 аминокислотных остатков, а молекулярные массы потенциальных продуктов, рассчитанные по количеству аминокислот, как правило, составляют 53—56 кДа, что хорошо согласуется с молекулярной массой ме-такрилатредуктазы, определенной ранее в эксперименте [7].
Гомологичная последовательность расположена на N-конце белка или в непосредственной близости от него (на расстоянии 30—40 аминокислот). Поскольку нативная метакрилатредук-таза является периплазматическим белком и, ве-
Распространение белков с аминокислотными последовательностями, имеющими значительное сходство с ]М-концом метакрилатредуктазы бактерии ОеоЬаМег яи1[иггес1исет АМ-1, среди микроорганизмов
сл о ы
Домен Класс Организм Номер последовательности в базе данных Белок, функция Наличие дополнительных сходных последовательностей в геноме Общая площадь наложения (% от общей длины фрагмента) Идентичность/сходство (% от общей длины фрагмента) Е Расчетная Mr, Да Возможное наличие сигнального пептида [участок отщепления], Tat-мотив
ß-Proteo -bacteria Parasutterella excrementihomi-nis YIT 11859 ZP 08323581.1 флавоцитохром с 17 92 72/84 9 х Ю-9 57834.8 Tat пептид из 50 аминокислот [ANA-AA], NRRKFLS
ß-Proteo -bacteria Burkholderiales bacterium 1147 ZP_07343128.1 флавиновая субъединица флаво-цитохрома с 6 88 71/79 3 х Ю-8 55660.9 Tat пептид из 34 аминокислот [ASA-NP], SRRNLLG
ß-Proteo -bacteria Sutterella wad- sworthensis 3145B ZP 08014924.1 гипотетический белок HMPREF9464 00 143 15 88 92/9
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.