ГЕНЕТИКА, 2013, том 49, № 11, с. 1345-1352
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 575.174.015.3
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ВНУТРЕННЕГО ТРАНСКРИБИРУЕМОГО СПЕЙСЕРА ITS1 И РИБОСОМНОГО ГЕНА 5.8S
У ВИДОВ РОДА Malus
© 2013 г. Е. Н. Савельева1, К. В. Борис2, Е. З. Кочиева2, А. М. Кудрявцев1
1 Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, Москва 119991
e-mail: saveleva_kate@mail.ru 2Центр "Биоинженерия"Российской академии наук, Москва 117312 Поступила в редакцию 16.04.2013 г.
Определена нуклеотидная последовательность фрагмента ITS1-5.8S области рибосомного оперона в 41 образце видов Malus. Общая длина сравниваемых последовательностей составила от 389 до 392 пн. Район гена 5.8S был полностью консервативным у всех образцов. Уровень полиморфизма ITS1 составил 14%. Были выявлены как видоспецифичные замены, так и замены, характерные для групп видов. Анализ полученных секвенированных последовательностей видов M. orientalis и M. turk-menorum выявил их полную идентичность, что говорит о необходимости проведения дополнительных исследований с привлечением большего количества образцов обоих видов из других коллекций для уточнения таксономического статуса вида M. turkmenorum. Также подтверждены ранее полученные данные о синонимичности видов M. baccata, M. mandshurica, M. pallasiana, M. sachalinensis.
DOI: 10.7868/S0016675813110143
Род Malus (яблоня), как и ряд других экономически важных плодовых культур (Pyrus, Cydonia, Aronia, Chaenomeles, Crateagus, Sorbus), относится к подсемейству Maloidae семейства Rosaceae [1].
Согласно различным современным классификациям, род Malus включает от 8 до 78 дикорастущих видов [2]. Несмотря на сравнительно давнее время доместикации (около 4 тыс. лет назад) и значение яблони как важной плодовой сельскохозяйственной культуры, до сих пор существуют вопросы, связанные с видовым составом и филогенией рода Malus.
Большинство существующих классификаций рода Malus традиционно основаны на морфологических признаках, таких как структура вегетативных и генеративных органов, а также географическом распространении [3]. Полиплоидность многих представителей рода, способность к межвидовой гибридизации и высокий уровень внутривидового полиморфизма сильно затрудняют классификацию и служат причиной разногласий по поводу видового состава рода.
В связи со сложностью использования только морфологических признаков для исследования проблем филогении и таксономии рода Malus все чаще активно используются методы молекулярного анализа генома.
В настоящее время для установления таксономического состава многих семейств и родов, уточнения филогенетических связей и видовой идентификации образцов у представителей мно-
гих родов растений часто используется ITS1-5.8S-ITS2 область рибосомного оперона [4—6]. Ранее ITS1-5.8S-ITS2 последовательность уже использовалась в ряде работ для анализа семейства Rosaceae, например у представителей родов Pyrus [7], Sorbus [8], а также видов рода Malus [2, 9, 10].
В ВНИИР им. Н.И. Вавилова содержится уникальная коллекция образцов рода Malus из различных географических зон России, а также из центра происхождения яблони — Средней Азии. Ранее молекулярно-генетические исследования данной коллекции не проводились. Поэтому представляет интерес проведение молекулярно-генетической характеристики этих образцов, в том числе видов, взятых для исследования впервые, таких как M. denticulata, M. turkmenorum, с целью определения таксономической принадлежности образца, оценки межвидового и внутривидового полиморфизма генома. Для анализа был выбран район ITS1-5.8S рода Malus.
В работу был отобран 41 образец 39 видов Malus, относящихся к различным сериям секций Eumalus, Baccatomalus (Gymnomeles), Sorbomalus, Chloromeles, Eriolobus, Docyniopsis (табл. 1). В качестве внешней группы были взяты два образца: Pyrus (Pyrus dimorphophylla EU149953) и Spiraea salicifolia JQ041777. ДНК была выделена по методике, предложенной Puchooa [11].
В ходе работы были секвенированы и проанализированы последовательности района транскрибируемого спейсера ITS1 и гена 5.8S рРНК у
Таблица 1. Образцы Malus, взятые в анализ*
№ п.п. Видовое название/ номер в каталоге коллекции ВИР Номер в GenBank Длина фрагмента ITS1, пн № п.п. Видовое название/ номер в каталоге коллекции ВИР Номер в GenBank Длина фрагмента ITS1, пн
СЕКЦИЯ НАСТОЯЩИЕ ЯБЛОНИ (Sect. Eumalus Zabel.)
Серия Азиатские яблони (Ser. Asiaticae Langenf.)
1 M. asiatica Nakai./2343 KF186578 224 24 M. ringo Rehd./41280 KF186579 224
Серия Киргизские яблони (Ser. Kirghisores Langenf.)
2 M. sieversii Roem./13280 KF186580 224 25 M. pumila Mill./2383 KF186581 224
3 M. pumila v. gallica Mill./ 2385 KF186582 226 26 M. niedzwetzkyana Dieck./29429 KF186583 224
4 M. purpurea Rehd./2392 KF186584 224 27 M. purpurea v. adenhamensis Rehd./2393 KF186585 224
Серия Восточные яблони (Ser. Orientalis Langenf.)
5 M. orientalis Uglitz./29484 KF186586 224 28 M. turkmenorum Juz. et M. Pop./ 13283 KF186587 224
Серия Настоящие яблони (Ser. Malus)
6 M. sylvestris 123 Mill./^^ KF186588 227 29 M. sylvestris Mill./41639 KF186589 226
7 M. domestica, cult. Golden Delicious./501 KF186590 224 30 M. caspiriensis Langenf./14943 KF186591 227
8 M. prunifolia Borkh./2430 KF186592 224 31 M. spectabilis Borkh./2415 KF186593 224
СЕКЦИЯ ЯГОДНЫЕ ЯБЛОНИ (Sect. Baccatomalus/ Rehd., Gymnomeles)
Серия ягодные яблони (Ser. Baccatae Rehd.)
9 M. baccata v. coerulescens Borkh./2333 KF186594 224 32 M. mandshurica Kom./14947А KF186595 224
10 M. pallasiana Juz./14957А KF186596 224 33 M. sachalinensis Juz./41275 KF186597 224
11 M. cerasifera Spach./29494 KF186598 224 34 M. denticulata Lavall./29416 KF186599 224
12 M. robusta Rehd./43199 KF186600 224
Серия Хубейские яблони (Ser. Hupehensis Langenf.)
13 M. hupehensis KF186601 226
Rehd./14945А
СЕКЦИЯ РЯБИНОВИДНЫЕ ЯБЛОНИ (Sect. Sorbomalus Zabel.)
14 M. sieboldii Rehd./2322 KF186602 224 35 M. sargentii Rehd./2428 KF186603 224
15 M. zumi Rehd./2427 KF186604 224 36 M. sheideckerii Zabel./2407 KF186605 224
16 M. arnoldiana Rehd./2312 KF186606 224 37 M. floribunda Sieb./2346 KF186607 224
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ 1347
Таблица 1. (Окончание)
№ п.п. Видовое название/ номер в каталоге коллекции ВИР Номер в GenBank Длина фрагмента ITS1, пн № п.п. Видовое название/ номер в каталоге коллекции ВИР Номер в GenBank Длина фрагмента ITS1, пн
Серия Ганьсуйские яблони (Ser. Kansuenses Rehd.)
17 18 M. toringoides Schneid./14959A M. honanensis Rehd./13103 KF186608 KF186610 224 225 38 M. transitoria Schneid./2424 KF186609 224
СЕКЦИЯ ЗЕЛЕНОПЛОДНЫЕ ЯБЛОНИ (Sect. Chloromeles/Deone./Rehd.)
Серия Венечные яблони (Ser. Coronariae Rehd.)
19 M. soulardii KF186611 224 39 M. coronaria KF186612 226
Britt./2414 Mill./2336
20 M. ioensis KF186613 224 40 M. platycarpa KF186614 224
Britt./2352 Rehd./29489
СЕКЦИЯ ЭРИОЛОБУС (Sect. Eriolobus/CK Schneid/Langenf.)
21 M. florentina KF186615 224
Schneid./2345
СЕКЦИЯ ДОЦИНИОПСИС (Sect. Docyniopsis/CK Schneid/Langenf.)
22 M. sikkimensis KF186616 224
Koehne./2412
23 Антоновка KF186617 224 41 Антоновка из KF186618 224
обыкновенная/711 Севастопольской/
8920
* Согласно классификации В. Лангенфельда [3].
Таблица 2. Характеристика нуклеотидных последовательностей ITS1 и гена 5.8S видов Malus
Число Число парсимони-
Длина, пн вариабельных информативных GC-состав, % Транзиции/трансверсии
сайтов сайтов
ITS1 224-227 32 25 67.5 7 (22%)/25 (78%)
5.8S 165 0 0 58.8 -
41 образца Malus. Нами были использованы универсальные последовательности праймеров, предложенные Уайтом (ITS4: TCCTC CGCTTAT-TGATATGC, ITS5: GGAAGTAAAAGTCGTAA-CAAG) [12].
Как и ожидалось, нуклеотидная последовательность гена 5.8S оказалось высококонсервативной. Длина гена 5.8S рРНК у всех проанализированных представителей рода яблони составила 165 пн, на всем протяжении замен выявлено не было (табл. 2).
Длина ITS1 последовательности у рассмотренных видов Malus составляет 224 пн, за исключением M. caspiriensis и M. sylvestris, у которых протяженность этого участка равна 227 пн (табл. 1).
В последовательности фрагмента ITS1 было выявлено 32 вариабельных сайта (табл. 2). Таким образом, уровень нуклеотидного полиморфизма изучаемого фрагмента был относительно высок и составил 14%.
При анализе ITS1 последовательностей представителей рода Malus было обнаружено несколько видоспецифичных замен. Так, например, у M. honanensis обнаружена замена Т50А. Для M. soulardii и M. florentina были характерны видо-специфичные замены G42T и G70A соответственно.
Помимо единичных нуклеотидных замен в последовательности внутреннего транскрибируемого спейсера ITS1 был выявлен ряд замен, характерных для групп видов Malus. Так, замена A106G
была выявлена только у видов M. sargentii, M. zumi и M. platycarpa. Для 17 видов в положениях 112 и 113 были выявлены двунукдеотидные замены GA, в то время как у остальных видов в этом положении детектировался динуклеотид ТТ. У видов M. cerasifera, M. purpurea, M. robusta в положении 113 была замена Т на A (табл. 3).
Помимо замен в последовательности ITS 1 были также идентифицированы индели. Так, динук-леотидная инсерция АА была характерна для последовательностей видов M. pumila var. gallica, M. sylvestris 41639, M. hupehensis, M. coronaria, а инсерция (АТС) характерна для видов M. caspir-iensis и M. sylvestris 123. Кроме того, у вида M. ho-nanensis обнаружена видоспецифичная мононук-леотидная инсерция (А).
Отдельный интерес представлял вид M. turk-menorum, ранее не включавшийся в молекулярные исследования и таксономический статус которого неоднозначен. Так, согласно классификации В. Лангенфельда, образцы M. turkmenorum выделяют в отдельный вид и вместе с родственным видом M. orientalis включают в серию Orientalis (Восточные яблони) [13]. Ранее были показаны различия в центрах происхождения этих двух видов: если для M. orientalis установленным центром происхождения является Кавказ, то для M. turkmenorum это горные области Ирана
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.