ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 7, с. 821-825
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 575.1:576.3
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК РАЙОНА ПРИКРЕПЛЕНИЯ Х-ХРОМОСОМ К ЯДЕРНОЙ ОБОЛОЧКЕ ТРОФОЦИТОВ Anopheles messeae Fall.
© 2015 г. Г. Н. Артемов, О. Ю. Васильева, В. Н. Стегний
Научно-исследовательский институт биологии и биофизики, Национальный исследовательский Томский государственный университет, Томск 634050
e-mail: g-artemov@mail.ru Поступила в редакцию 06.05.2014 г.
Политенные хромосомы трофоцитов яичников малярийных комаров образуют мощные контакты с ядерной оболочкой. Наличие контактов, их положение на хромосомах трофоцитов и морфологические особенности являются видоспецифиными признаками у малярийных комаров. Определить природу этих межвидовых различий в ядерной архитектуре важно как для понимания функции ядра, так и для оценки значения пространственной организации хромосом в эволюции. С помощью дот-блот-гибридизации сравнивали последовательности ДНК библиотеки клонов района прикрепления Х-хромосомы к ядерной оболочке трофоцитов яичников Anopheles messeae с ДНК-пробами: 1) района прикрепления X-хромосомы An. atroparvus, 2) района прикрепления ЗЯ-хромосомы An. messeae и 3) прицентромерного района хромосомы 2 An. messeae, не имеющего выраженных контактов с ядерной оболочкой. Было показано, что районы прикрепления хромосом имеют значительно больше общих последовательностей ДНК по сравнению с прицентромерным районом хромосомы 2. При этом последовательности, общие для районов прикрепления, в большинстве своем потенциально способны участвовать в образовании петлевых доменов хроматина и взаимодействовать с некоторыми каркасными структурами ядра по данным анализа в программе ChrClass. Полученные результаты свидетельствуют в пользу важной роли ДНК в формировании мощных контактов хромосом с ядерной оболочкой трофоцитов у малярийных комаров.
DOI: 10.7868/S0016675815060028
Пространственная организация интерфазного ядра изучается с конца XIX в. [1] и остается до сих пор актуальной проблемой [2—4]. Гены, хромосомные сегменты и геном как целое упорядочены в пространстве ядра [5—8]. Этот порядок обеспечивается взаимодействием хромосом с ядерной оболочкой и друг с другом [9—11]. У малярийных комаров в трофоцитах яичников формируются политенные хромосомы, которые образуют выраженные контакты с ядерной оболочкой (районы прикрепления — РП), которые можно наблюдать даже с использованием только световой микроскопии [12—14]. Близкие виды малярийных комаров различаются по наличию или отсутствию РП хромосом, месту расположения этих районов на хромосоме и их морфологией. Молекулярная организация таких районов вызывает интерес, так как они могут быть обогащены последовательностями ДНК и/или иметь особый белковый состав хроматина, которые обеспечивают крепления к ядерной оболочке [11]. Анализ молекулярной структуры РП хромосом необходимо проводить, сравнивая организацию РП разных хромосом и хромосом близкородственных видов. Такой подход позволит выявить общие элементы, которые
обеспечивают свойство контакта хроматина с ядерной оболочкой.
Ранее нами была получена ДНК из РП X-хро-мосомы Anopheles messeae Fall. и определена ее нуклеотидная последовательность [14]. При гибридизации этой ДНК с политенными хромосомами An. messeae (рис. 1,a) яркие сигналы локализуются в районе прикрепления 3Я-хромосомы (район 32d), прицентромерном гетерохроматине (ПГ) хромосомы 2 (район 15d) и Х-хромосомы. Сходная картина наблюдается при гибридизации ДНК РП X-хромосомы с хромосомами An. atroparvus Thiel. (рис. 1,5).
Прицентромерные районы хромосомы 2 и X-хро-мосомы An. messeae не являются РП, и неспецифичное распределение метки на хромосомах этих видов свидетельствует об отсутствии прямого соответствия между последовательностью ДНК РП и свойством хромосомы образовать контакт с ядерной оболочкой. Нами было сделано предположение, что РП образуют последовательности ДНК разных классов — те, которые участвуют в контакте с ядерной оболочкой, и те, которые характерны только для гетерохроматина.
Рис. 1. Локализация ДНК РП X-хромосомы An. messeae на политенных хромосомах трофоцитов An. messeae (а) и в РП XL-хромосомы An. atroparvus (б).
«tfi&k Ж VT 9
4
" I
% W' i
rt 1
3R 3L
C
Na
C
2L * itff
20 мкм
5a
C
C
C
2R
32d
15d
а
В настоящем исследовании нами был проведен анализ ДНК библиотеки клонов из РП Х-хро-мосомы Ап. швззвав в программе СИгС1а88 [15, 16] с целью поиска ДНК скелетных ядерных структур. Полученные ранее с помощью микродиссек-ции ДНК-пробы РП 3Я-хромосомы Ап. швззвав и Х-хромосомыАп. а^врагут [14, 17], а также ДНК из ПГ хромосомы 2 Ап. швззвав гибридизовали с
Оценка содержания последовательностей ДНК, участвующих в образовании хроматиновых петель, в РП Х-хро-мосомы Ап. твзявае по результатам анализа в СЬгСЫ8
Классы ДНК Число клонов
SAR/MAR 57
ялДНК 48
скДНК 63
срДНК 111
Прочие последовательности ДНК 76
Всего 300
Примечание. ДНК, потенциально связанная с синаптонем-ным комплексом (скДНК), ядерной ламиной (ялДНК), белковыми сердцевинами розеткоподобных структур (срДНК).
иммобилизованной на нитроцеллюлозной мембране библиотекой клонов ДНК X-хромосомы An. messeae. Микродиссекцию района ПГ хромосомы 2 An. messeae осуществляли как описано в литературе [14, 18]. Дот-блот-гибридизацию проводили с использованием набора реактивов Biotin Chromogenic Detection Kit (Fermentas) по предложенному протоколу. Основная цель настоящего исследования заключалась в том, чтобы выявить последовательности ДНК, общие для РП трофо-цитов малярийных комаров, и описать их.
Последовательности библиотеки клонов РП X-хромосомы An. messeae были проанализированы в программе ChrClass. Программа ChrClass базируется на сравнительном анализе характеристик последовательностей ДНК, которые предположительно при участии белков ядерного матрикса (SAR/MAR), ядерной ламины (ялДНК), синаптонемного комплекса (скДНК) и белковых сердцевин розеткоподобных структур (срДНК) формируют петли хроматина [15, 16]. По результатам анализа около 75% клонов оказались гомологичны ДНК, потенциально способной организовывать хроматиновые петли (таблица).
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК
823
s s s s
РП XL i fc H a X & ae R sea ^ 8 ae L sea 2 ess РП XL i fc H a x & ae R sea ^ 8 L 2 ae e esse РП XL i fc H a x & ae R sea ^ 8 ae L sea 2 ess РП XL i fc H a X & ae R sea ^ 8 L 2 ae e esse
An. messeae С £ Рн a n. A С g N П An. An. messeae С £ Рн a n. A с ё N u П s An. An. messeae С £ Рн « n. A с ё N П An. An. messeae С £ Рн a n. A с ё N u П s An.
TR GAAAGGAGAAA — BEL13-I_AG — L1MC4_5end • TR TAC -
Gypsy43-I_AG-int - — ERV3 — MUDSOLT1 — EnSpm-3_HV -
Mes2bc_18 6 — Sola1-9_AP © RTE-9_SP — TR TC -
Mes2bc_144 <1 - — * AAGAP005897 — L1-2_Ttr — Mes2bc_431 —
Mes2bc_153 - — Mes2bc_277 • © L1HS • • Ш Mes2bc_432
Mes2bc_158 - — EnSpm-6_VV — Mes2bc_395 t о TONT1_LE_I -
L1MB5 - — BEL13-I_AG — Mes2bc_403 - a L2A -
ZFERV-2-I_DR - — EnSpm-3_HV/ Chapaev3-2_AC — Outcast • — L1_Mur2_orf2 -
Mes2bc_204 ■ Mes2bc_337 ft — L1MEf_5end • • m L1MA6 H -
TR GAAGTATGAAAGA - • Penelope-13_HM — Mes2bc_418 — Sola1-7_AP -
Рис. 2. Результат дот-блот-гибридизации библиотеки клонов РП Х-хромосомы Ап. messeae с ДНК РП хромосом XL Ап. а^вратш, 3Я Ап. messeae и прицентромерного гетерохроматина (ПГ) хромосомы 2 Ап. те88еае\ * — последовательность ДНК, гомологичная четвертому экзону гена ААОАР005897 Ап. gambiae; ТЯ — тандемные повторы.
Проведенная нами оценка показывает, что в РП Х-хромосомы Ап. messeae расположены последовательности ДНК, потенциально способные взаимодействовать со скелетными структурами ядра. Полученные результаты требуют подтверждения дополнительными экспериментальными подходами, но для нашего исследования важно, что в среднем каждая шестая из проанализированных последовательностей ДНК района прикрепления Х-хро-мосомы потенциально способна связываться с ядерной ламиной.
Нами также был проведен сравнительный анализ последовательности ДНК, выделенной из РП Х-хромосомы Ап. messeae, с районспецифичной ДНК хромосом Ап. messeae и Х-хромосомы Ап. at-roparvus. Для этого были выбраны последовательности ДНК библиотеки клонов РП Х-хромосомы Ап. messeae, гомологичные генам, последовательностям мобильных элементов, а также содержащие тандемные повторы [14]. Кроме того, для гибридизации использовали клоны библиотеки, содержащие ДНК, потенциально способные образовывать петельные структуры по данным анализа в программе СИтС^ (Ме82Ъс_18, Мез2Ьс_153, Мез2Ъс_158, Ме82Ъс_204, Ме82Ъс_277, Мез2Ъс_337, Мез2Ъс_395, Ме82Ъс_403, Ме82Ъс_418, Ме82Ъс_431, Ме82Ъс_432).
В результате дот-блот-гибридизации ДНК изучаемых районов на нитроцеллюлозной мембране образовывались пятна различной яркости. В настоящей работе мы проводили только качественную оценку наличия или отсутствия в изучаемом районе тех или иных последовательностей ДНК библиотеки клонов РП Х-хромосомы Ап. messeae (рис. 2).
Полученные в ходе дот-блот-гибридизации результаты демонстрируют, что РП хромосом, а также прицентромерный гетерохроматин хромосом, не взаимодействующих с ядерной оболочкой, различаются по составу последовательностей ДНК. Например, последовательности ДНК, которые присутствуют в РП ХЬ-хромосом Ап. messeae и Ап. atroparvus, отсутствуют в РП ЗЯ-хромосомы Ап. messeae и ПГ хромосомы 2 Ап. messeae. Примечательно, что РП Х-хромосо-мы Ап. messeae имеет больше общих последовательностей ДНК с РП Х-хромосомы Ап. atroparvus, чем с РП ЗЯ-хромосомы и тем более ПГ хромосомы 2. Однако выявлены и такие последовательности, которые были представлены только в районах хромосом Ап. messeae и не обнаружены в РП Х-хромосомы Ап. atroparvus. Следует также обратить внимание, что если клоны библиотеки ги-бридизовались с ДНК прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2 Ап. messeae, то гибриди-
зация также происходила с РП хромосом 3R An. messeae и/или X-хромосомы An. atroparvus. Такой ситуации не наблюдается в эксперименте с ДНК РП 3R-хромосомы
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.