ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 2, с. 147-155
ОБЩАЯ ГЕНЕТИКА
УДК 575.224:599.9
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРИРОДНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ АНТИМУТАГЕНОВ КАК РЕГУЛЯТОРОВ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ОБЛУЧЕНИЯ
© 2015 г. В. Ф. Михайлов1, А. А. Шишкина1, И. М. Васильева2, Л. В. Шуленина1, Н. Ф. Раева1, Е. А. Рогожин3, М. И. Старцев1, Г. Д. Засухина2, С. П. Громов4, М. В. Алфимов4
Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна Федерального медико-биологического агентства, Москва 123182 e-mail: vfmi@mail.ru
2Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, Москва 119333
e-mail: zasukhina@vigg.ru 3Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Москва 117997 4Центр фотохимии Российской академии наук, Москва 119421 Поступила в редакцию 15.05.2014 г.
Изучали влияние растительных пептидов тионина Ns-W2, выделенного из семян чернушки посевной (Nigella sativa), в-пуротионина из проростков пшеницы (Triticum kiharae), а также синтетического антимутагена (краун-соединения) на экспрессию ряда генов, принимающих участие в контроле клеточного гомеостаза, процессов онкогенеза и радиационном ответе в клетках рабдомиосар-комы человека (RD-клетки), Т-лимфобластоидной линии клеток Jukart и клетках крови. Все эти агенты действовали как антимутагены-антиканцерогены, снижая в опухолевых клетках экспрессию генов, участвующих в канцерогенезе (гены семейств ММР, TIMP, IAP, гены G-белков). Выраженное снижение уровня мРНК вызывал тионин Ns-W2 и наименьшее влияние демонстрировал в-пуроти-онин. Антимутагены оказывали слабое воздействие на уровень мРНК ряда исследованных генов в нормальных клетках крови. Тионин Ns-W2 в опухолевых клетках приводил к снижению содержания онкогенной зрелой miR-21, но не влиял на уровень мРНК генар53 и зрелой miR-34, регулируемой активностью онкосупрессорар53. Установлено, что тионин Ns-W2 обладает цитотоксическим действием, индуцируя гибель клеток RD и лимфомы. Воздействие на эти клетки ионизирующей радиации усиливало ингибирующий эффект тионина на экспрессию генов, участвующих в онкогенезе. Эти данные указывают на то, что тионин можно расценивать как перспективный антиканцероген.
DOI: 10.7868/S0016675814110095
Изучение экспрессии конкретных генов в клетках крови человека используется для определения ответа клеток на радиационные воздействия и как стратегический подход к решению проблем радиационной биодозиметрии [1]. Степень экспрессии гена р53 может служить для оценки эффектов космической радиации, отсутствия гравитации, влияния факторов окружающей среды космического пространства [2]. Сведения об изменениях в генной экспрессии особенно важны для информации о воздействии радиации на медицинских работников, подвергающихся различным видам излучений [3].
Особого внимания заслуживает оценка содержания зрелых микроРНК (ш1Я) — некодирующих протеины одноцепочечных РНК (состоящих из 20—24 нуклеотидов), контролирующих большой спектр биологических функций через регуляцию
сотен генов-мишеней [4, 5]. Индивидуальные ш1Я могут потенциально оказывать влияние на функционирование многих типов ш1Я, а экспрессия одного гена может регулироваться различными ш1Я, что отражает сложную картину событий в процессах пролиферации, гематопоэза, туморо-генеза. Полагают, что изменение экспрессии более чем 50% протеин-кодирующих генов, контролируемых с помощью ш1Я, приводило к дестабилизации или трансляционной репрессии мРНК [6]. В связи с тем, что к последствиям воздействия радиации относится развитие малигнизации, особое внимание уделено анализу экспрессии ш1Я, которые функционируют как в качестве супрес-сора опухолевой трансформации, так и "стимулятора" этого процесса.
Экспрессия ш1Я-21 связана с проявлением многих форм рака (в том числе рака простаты),
что коррелирует с агрессивностью опухоли, ан-дроген-зависимостью и метастазированием [7]. По этой причине определение экспрессии этой miR используется в диагностических и прогностических целях. Установлено, что miR-21 играет ключевую роль в ответе на химиотерапию [8], miR-34 функционирует как супрессор развития опухолей [9], miR-34 индуцирует апоптоз и является мишенью онкосупрессора р53. MiR, естественно, включаются и в радиационный ответ клетки [4, 6, 10]. Было показано, что образование miR-5а, miR-l6, miR-155 и miR-21 подавлялось при облучении ТК-6 клеток, тогда как экспрессия ряда других miR (-17, -18, -19) была повышена. Ранее мы исследовали в клетках крови и в злокачественных клетках (RD) уровни экспрессии генов, принимающих участие в трансформации нормальной клетки в злокачественную (включая ген-супрессорр53, протоонкогены kRas, гены семейств матриксных металлопротеиназ (ММР), тканевых ингибиторов матриксных металлопро-теиназ (TIMP) и др.), анализировали экспрессию этих генов в клетках, обработанных антимутагенами [11]. В настоящей работе были применены природные антимутагены — пептиды, выделенные из проростков пшеницы ф-пуротионин) и из семян чернушки посевной (Nigellasativa). В качестве синтетического антимутагена было использовано краун-соединение (C18H26N2O7), которое снижает повреждающее действие гамма-радиации и хлорида кадмия в клетках человека, в том числе и в клетках пациентов с наследственными заболеваниями, связанными с повышением чувствительности к некоторым физическим и химическим мутагенам, обусловленной дефектами в системах репарации ДНК [12—14]. Следует подчеркнуть, что в настоящее время накоплен большой материал по антимутагенезу-антиканцерогенезу при использовании растительных экстрактов, которые оказались эффективными не только для уменьшения повреждающего действия мутагенов in vivo и in vitro, но и для снижения репродуктивного потенциала опухолевых клеток [15— 17]. Смесь ряда экстрактов растений (фитоадап-тогенов) оказалась эффективной в профилактике опухолей у чувствительных к развитию рака линий мышей [18].
В настоящем исследовании новый подход заключается в изучении эффектов ряда пептидов, выделенных из растений, и синтетического антимутагена (краун-соединения) на основе сравнительного анализа действия этих препаратов на экспрессию ряда генов, принимающих участие в процессах онкогенеза и радиационном ответе.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культура клеток рабдомиосаркомы человека (RD-клетки). В экспериментах использовали мо-
нослой клеток, культивируемый в среде DMEM (модифицированная среда Дульбекко) с добавлением 3%-ной телячьей эмбриональной сыворотки. Конечная концентрация клеток составляла ~1 млн/мл.
Культивирование клеток крови. Кровь брали из вены здоровых доноров и помещали в гепарини-зированные пробирки. Перед посадкой кровь суспендировали, добавляли среду RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium), содержащую 10% инактивированной сыворотки крупного рогатого скота, глутамин (30 мг/100 мл среды), пенициллин (1000 ед/100 мл среды), ФГА (0.5 мг/100 мл среды). Полученный раствор разливали по 3 мл в стерильные флаконы и инкубировали при 37°С в течение суток.
Культура клеток линии Jukart. Культура представлена Т-лимфобластоидной линией клеток, полученной из T-клеточной формы острого лим-фобластоидного лейкоза. В эксперименте использовали клетки в концентрации 3 х 105 в 1 мл среды RPMI с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой.
Обработка клеток антимутагенами. Антимутагены вносили через 20—24 ч после посадки клеток и через сутки после этого определяли выживаемость клеток и исследовали активность генов. Использовали следующие антимутагены: а) кра-ун-соединение (C18H26N2O7, 6.7 х 10-5 мкМ); б) тионин Ns-W2 семян чернушки посевной (Nigella sativa) (10 мкг/мл среды); в) ß-пуротионин пшеницы (Triticum kiharae) (10 мкг/мл среды).
Облучение клеток in vitro. Рентгеновское облучение культур клеток осуществляли на установке "РУСТ-М1" при напряжении 200 кВ, силе тока 2.5 мА на алюминиевом фильтре 1.5 мм с мощностью дозы 0.85 Гр/мин.
Определение уровня экспрессии генов. Уровень экспрессии генов оценивали по содержанию в клетках их мРНК. Количественное определение экспрессии генов проводили методом двухста-дийной ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием технологии TaqMan или в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I. Тотальную РНК выделяли тризольным методом с использованием набора "Trizol RNA Prep 100" (ООО "Лаборатория Изоген") в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) использовали набор реактивов для обратной транскрипции "GenePak RT-PCR Core" (ООО "Лаборатория Изоген"), содержащий обратную транскрипта-зу M-MLV и случайные гексануклеотидные прай-меры. Амплификацию исследуемых генов проводили на амплификаторе "DTprime 5М3" (НПО "ДНК-Технология") в объеме 25 мкл, содержащем готовую реакционную смесь для ПЦР, кДНК
Таблица 1. Последовательности праймеров и зондов к исследуемым генам и условия проведения ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ)
Ген Последовательности 5'—3' прямого (Е) и обратного (Я) праймеров и зондов Условия ПЦР-РВ
MMP-2 е АСАГСААааасАТТСАааАа Я: СТОАОСОАТаССАТСАААТА 95°С/5 мин, далее 50 циклов: 95°С/15 с, 55°С/35 с, 72°С/40 с
MMP-7 Е ССАТТТАОСААТТАГОТСАСССТТТТ Я: ААТААОАСАСАОТСАСАССАТАААОаА Зонд: Е\М-ТТаСАаТГОаТТТТТаААГОТСТТТСАСТСС-ВВД1 95°С/5 мин, далее 40 циклов: 95°С/13 с, 60°С/45 с
MMP-9 Е ТСТТСССТООАОАССТОАОА Я: АТТТСОАСТСТССАСОСАТС 95°С/5 мин, далее 50 циклов: 95°С/15 с, 58°С/35 с, 72°С/40 с
MMP-13 Е: СССТТСТТСАСАСАОАСАСТААСО Я: ТАААСАОААТСАААООССАСАТС Зонд: ЕАМ-АССАСТаСТСТТТТаТСТССТаТСТТТААГО-ВВД1 95°С/5 мин, далее 40 циклов: 95°С/13 с, 60°С/45 с
TIMP-1 Е: АОАССТСАСТОТТООСТОТОАО Я: ОАСТООААОСССТТТТСАОАО 95°С/5 мин, далее 40 циклов: 95°С/15 с, 53°С/35 с, 72°С/40 с
TIMP-2 Е: АЮСАСАСАСССТСТОТОА Я: СТСТОТОАСССАОТССАТСС 95°С/5 мин, далее 40 циклов: 95°С/15 с, 53°С/35 с, 72°С/40 с
RhoA Е СОСТТТТОООТАСАТООАОТ Я: СААОСААаааСАСССАОАТТ 95°С/5 мин, далее 40 циклов: 95°С/15 с, 60°С/60 с
в-actin Е СОООАААТСОТОСОТОАС Я: ТООААООТООАСАОСОАОО 95°С/5 мин, далее 40 циклов: 95°С/15 с, 60°С/35 с, 72°С/40 с
HIAP-1 Е: СТСААТООАОТОСТСАТСТО Я: САОССАОАООСОАТАТТСАТС 95°С/2 мин, далее 40 ци
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.