1 2 3 4 5 6
Рис. 1. Образцы SmaI-рестрикции геномной ДНК штаммов S. thermophilus. 1 - ВС313, 2 - ВС314, 3 -ВС317, 4 - ВС329, 5 - ВС332, 6 - ВС310.
BC233, BC236, BC247, BC250, BC257, BC259, BC310, BC311, BC313, BC314, BC316, BC317, BC322, BC323, BC324, BC329, BC332, BC337, BC338. В работе также использованы два штамма -В7637 и АТСС19258 из ВКПМ (ГосНИИгенетика). Более полно информация об использованных штаммах представлена в работе [2].
Среды и условия культивирования. Основной средой при выделении и культивировании бактериальных культур служила агаризованная питательная среда М21 [5]. Чашки с посевами инкубировали в термостате при температуре 42°С в течение 48 ч.
Приготовление препаратов для проведения пульс-гель-электрофореза геномной ДНК проводили как описано ранее [6]. Рестрикцию проводили по традиционным методикам [7] с использованием эндонуклеазы рестрикции SmaI и рабочих буферов фирмы "Fermentas" в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.
Пульс-гель-электрофорез геномной ДНК проводили в 1%-ном агарозном геле, приготовленном на агарозе "Sigma", тип А при напряжении поля
6 В/см в 0.5х TBE-буфере при температуре 14°С в аппарате CHEF-DRIII фирмы "BioRad". Использовали режим с постепенным изменением времени пульса с 5 до 15 с в течение 24 ч. По окончании процесса разделения SmaI-рестриктов гель прокрашивали бромистым этидием и фотографировали.
Изображения гелей получали при помощи системы регистрации результатов электрофореза Gel Imager-2 фирмы "Helicon". Затем сохраняли их в виде графических файлов с расширением .JPEG и экспортировали в программу для обработки гелей Gel-Imager.
Анализ рестриктограмм геномной ДНК, полученных методом PFGE. Сравнительный анализ рестриктограмм и построение филогенетической дендрограммы осуществляли с использованием компьютерного обеспечения BioNumerics (версия 4.0; "Applied Maths", Kortrijk, Belgium). Для анализа проводили вычисление подобия геномных фингерпринтов согласно алгоритму Дисе (Dice). Для построения дендрограммы использовали матрицу подобия, полученную согласно алгоритму последовательной кластеризации. Для вычисления статистической значимости были использованы два основных инструмента программы: метод выключения кластеров (cluster cut-off method) и кофенетическая корреляция (cophenetic correlation). Подсчет величин фрагментов осуществлялся в программе BioNumerics. В качестве ДНК-маркера величин фрагментов использовались фрагменты NoiI-рестрикции генома Escherichia coli штамма JC7623, определенные ранее [8].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Метод сравнения фингерпринтов, полученных при рестрикции геномной ДНК, широко используется для паспортизации культур бактерий одного вида, что в условиях продолжительного исследования коллекции штаммов, не имеющих генетических маркеров, является необходимым. Для штаммов термофильных стрептококков анализ фрагментов ДНК, полученных при использовании эндонуклеазы рестрикции SmaI, позволяет оценивать сходство геномов по числу общих (идентичных по величине) фрагментов рестрикции в составе полученных паттернов и разнообразие культур по величине их геномов [9, 10].
Рестриктограммы хромосомной ДНК изучаемых нами штаммов, полученные при помощи эндонуклеазы рестрикции SmaI, представлены на рис. 1. Как видно из приведенных результатов, фингерпринты разных штаммов сильно отличаются друг от друга. Штаммы исследованной нами коллекции характеризовались большим разнообразием в наборе рестрикционных фрагментов геномной ДНК, хотя для многих из них показано на-
СРАВНИТЕЛЬНЫМ АНАЛИЗ РАЗМЕРОВ ГЕНОМОВ
893
PFGE
о
00 _|_
о о
81.3Г 78.1П-
77.5
77.4
76.5 76.1
76. 73.5
71 64.8' 63.9)! _ 71.5Г
86.5
.2
84.8 84
1
61.6
I I, I I I I I 111,11 I I, I I , I I I, I I I I I I I ,1 I, I I
I
I I I I
I I I I I I I I
I I
II
I I
I I I
II
I
II
I I I I
I I
I I I
I
I
I
I
I
I
I I
I
I I
I I I I I I
I I
I I
I I
I I I
I I
I
I I
I I I
I
I
I
I I I I I
I I
I
I I I I I I
I I I
I I I I I
I
I
I
I I I I I I I I I I
I
I
I I I I I
I I
I
I
I
I I I I I I
I I
I
I
I
I I I I
I
I I
I
I
1 1 ВС337
1 1 1 ВС338
1 | |ВС310
1 1 ЦВС236
1IIII ВС247
1 1 | ВС322
1 1 ВС323
1 1 | ВС250
1 1ВС233
1 | |ВС329
1 1 1 | ВС311
1 1 | ВС314
1 1 | ВС221
1 1 | ВС223
II | ВС317
1 1 1 | ВС313
1 1 1 ВС201
1 1 | В7637
1 1 ВС324
1 1 | ВС216
1 ВС316
1 | | ВС332
1 1 1 ВС231
1 1 1 ВС257
1 1 ВС259
II 1 АТСС19258
Рис. 2. Дендрограмма родственных взаимоотношений штаммов 5. ШегторЫ1т, основанная на результатах сравнительного анализа фингерпринтов, полученных методом геномной рестрикции с использованием эндонуклеазы 5та1 и пульс-гель-электрофореза (согласно корреляции Дисе). Ветви дендрограммы, уровень подобия которых менее значения воспроизводимости (в данном случае значение составляет 70%), считаются разными кластерами и обозначены пунктиром. Ветви дендрограммы, уровень подобия которых превышает значение воспроизводимости, обозначены сплошной линией. Для каждой ветви представлены значения кофенетической корреляции. Справа от фингерпринтов -названия штаммов, а сверху - шкала величин фрагментов, выраженная в тпн.
76
личие близких или практически одинаковых по величине фрагментов (см. рис. 1, 2).
Результаты сравнительного анализа профилей рестрикции представлены в виде филогенетического дерева со схематичным изображением фрагментов геномной рестрикции изучаемых штаммов на рис. 2. Воспроизводимость (нижний критерий отнесения компонентов (штаммов) к одному кластеру) метода для данных штаммов составила 70%. Результаты кластерного анализа фингерпринтов позволили нам выделить четыре группы штаммов. В первую, самую многочисленную, вошло основное количество (22 из 26) изучаемых штаммов. Данный кластер штаммов расположен в верхней части рис. 2; уровни подобия штаммов, входящих в состав этого кластера, составляют значения от 71% до 86.5%. Второй кластер представлен одним штаммом ВС231, значение подобия геномного фингерпринта которого по отношению к другим штаммам составляет 64.8%. В третий кластер вошли штаммы ВС257 и ВС259, с уровнями подобия между собой 71.5%, а по отношению к остальным штаммам 63.9%. Четвертый кластер представлен одним штаммом
АТСС19258, уровень подобия которого по отношению к штаммам изучаемой нами коллекции составил 61.6%. На рис. 3, представляющем собой трехмерную дендрограмму, отражающую родственные взаимоотношения между штаммами, приведены данные, позволяющие оценить, насколько далеко расположены отделившиеся от основной коллекции штаммов отдельные культуры, отнесенные по результатам анализа к разным кластерам.
Измерив величины пробега фрагментов исследуемых штаммов и контрольных маркеров от линии старта, можно определить величины этих фрагментов. А сложение величин фрагментов дает значение размера всего генома изучаемых штаммов 5. ^вгторЫ1т. По полученным нами данным (см. таблицу) величина геномов у исследованных нами штаммов, определенная как сумма 5та1-рестриктов, сильно варьирует - от 1417 до 2075 тпн, т.е. различие между минимальным и максимальным значениями размера генома составляет около 600 тпн. По разным данным размер генома 5. ЛвгторЫ1т составляет от 1500 до 1824 тпн. [9-12]. Таким образом, на основании
Рис. 3. Трехмерное изображение дендрограммы родственных взаимоотношений штаммов 5. ^егжорЫ1т на основе сравнения фингерпринтов, полученных методом PFGE с использованием 5та1-рестрикции (согласно корреляции Дисе).
анализа результатов геномной рестрикции и, в частности, определения размеров геномов нами показано, что изучаемые нами штаммы обнаруживают значительный уровень различия по размерам своих геномов.
ОБСУЖДЕНИЕ
Генетическая организация бактерий термофильных стрептококков имеет ряд особенностей. Прежде всего представители вида Streptococcus thermophilus отличаются от других молочнокислых бактерий относительно небольшим размером генома. Например, для Lactobacillus del-brueckii subsp. bulgaricus размер хромосомы соответствует 2300 тпн [11], для Lactococcus lactis -2000-2700 тпн [13], а для Enterococcus sp. -3200 тпн [11]; среди видов стрептококков величина хромосомы варьирует в следующих пределах: S. mutans - 2030-2200 тпн [14, 15], S. agalactiae -2200 тпн [15], S. waius - 2150-2250 тпн [16, 17], S. macedonicus - 2150-2250 тпн [17, 18]. Геном S. thermophilus самый маленький и составляет по разным данным от 1500 до 1824 тпн [9-12, 14, 15]. Размер генома исследованных нами штаммов сильно варьирует и составляет значения от 1417 до 2075 тпн, что свидетельствует о значительной
внутривидовой дивергенции геномов изучаемых нами штаммов. Для рестриктов разной величины ошибка при определении их размера неодинакова. Особенно неточным может быть определение размера крупных рестриктов, размером порядка 300 тпн, из-за невозможности точного измерения очень короткой длины их пробега. По нашим оценкам ошибка при определении массы крупных фрагментов > 300 тпн может составлять не менее 10 тпн, а для фрагментов в 250-300, 100250 и 20-100 тпн - 6, 4 и 2 тпн соответственно.
Тот факт, что большинство исследованных штаммов были объединены в один кластер по результатам сравнительного анализа рестрикто-грамм, свидетельствует о достаточной консервативности расположения сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции 5та1. А возникновение вторичных кластеров в данном случае может быть объяснено возникновением генетических перестроек в областях генома, содержащих определенные сайты рестрикции, а также наличием точечных мутаций или инсерций, делеций в положениях последовательности, содержащей картируемый сайт [14]. Установлено, что одним фактором возникновения генетических перестроек может служить наличие в геноме 5. ^вгморЫ1т К-элемен-тов [19].
Величины фрагментов рестрикции геномной ДНК и
размеры геномов штаммов 5. thermophilus
№ ВС201 ВС216 ВС221 ВС223 ВС231 ВС233 ВС236 ВС247 ВС250 ВС257 ВС259 ВС310 ВС311 ВС313 ВС314 ВС316 ВС317 ВС322 ВС323 ВС324 ВС329 ВС332 ВС337 ВС338 В7637 АТСС 19258
1 344 539 326 332 539 235 326 476 252 358 367 305 401 351 344 506 539 539 332 423 378 320 289 266 476 353
2 286 291 253 253 338 187 205 21
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.