МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 3, с. 482-490
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 612.017.1:576.314
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РОЛИ CD4+ И CD8+ Т-КЛЕТОК В РАЗВИТИИ ТЯЖЕЛОЙ АСТМЫ# © 2015 г. X. Wang1, J. Wang2, C. Y. Xing1, R. Zang1, Y. Y. Pu1, Z. X. Yin1*
department of Respiration Medicine, Jinan Central Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan, Shandong Province, China, 250013 2Department of Community Health, Jinan Blood Supply Center, Jinan, Shandong Province, China, 250001
Поступила в редакцию 25.06.2014 г.
Принята к печати 22.07.2014 г.
Участие CD8+ Т-клеток в развитии бронхиальной астмы охарактеризовано недостаточно полно. В представленной работе сравнили механизмы участия CD4+ и CD8+ Т-клеток в развитии тяжелой астмы (ТА). Из базы данных GEO (Gene Expression Omnibus) получены результаты анализа профиля экспрессии генов с использованием микрочипов (GSE31773), включая данные по 20 образцам CD4+ и по 20 образцам CD8+ Т-клеток восьми здоровых индивидов (контроль, ЗК), четырех больных нетяжелой формой астмы (НТА) и восьми больных ТА. С помощью программного пакета Limma на языке программирования R в популяциях CD4+ и CD8+ Т-клеток идентифицировали гены, которые по-разному экспрессировались в группах НТА и ЗК, а также у больных ТА и НТА. С помощью пакета программ DAVID проведен анализ онтологии генов и изменений в распределении по биологическим процессам дифференциально экспрес-сируемых генов, общих в двух группах. Интерактивную сеть дифференциально экспрессируемых генов и значимых модулей использовали в дальнейшей работе. В CD4+ Т-клетках ЗК и НТА выявлена дифференциальная экспрессия 16 генов, тогда как при сравнении ЗК и группы ТА найдено 685 таких генов. В CD8+ Т-клетках обнаружили 719 генов, дифференциально экспрессирующихся в группах ЗК и НТА, и 1255 — в группах ЗК и ТА. Кроме того, 80 дифференциально экспрессируемых генов, общих для CD4+ Т-клеток, были вовлечены в каскады MAPKKK и процессы метаболизма молекул, входящих в эти каскады. Большая часть из 385 дифференциально экспрессируемых генов, общих для CD8+ Т-клеток, имели отношение к апоптозу и трансформации клеток. Более того, два достаточно больших модуля дифференциально экспрессируемых генов CD4+ Т-клеток были связаны с генами миелопероксидазы (MPO) и бактерицидного белка, увеличивающего проницаемость клеточной мембраны (BPI). Один модуль из CD8+ Т-клеток содержал гены PDHA1 и MRPL42, он был связан с гликолизом. Сделан вывод, что MPO и BPI в CD4+, и PDHA1 и MRPL42 в CD8+ Т-клетках можно использовать в качестве специфических маркеров прогрессии ТА. По-видимому, направленное воздействие на функции CD4+ и CD8+ Т-клеток позволит разработать новые подходы к терапии ТА.
Ключевые слова: CD4+ и CD8+ Т-клетки, тяжелая астма, дифференциально экспрессируемые гены, сеть взаимодействий, модульный анализ.
COMPARATIVE ANALYSIS OF THE ROLE OF CD4+ AND CD8+ T CELLS IN SEVERE ASTHMA DEVELOPMENT, by X. Wang1, J. Wang2, C. Y. Xing1, R. Zang1, Y. Y. Pu1, Z. X. Yin1* ^Department of Respiration Medicine, Jinan Central Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan, Shandong Province, 250013 China; *e-mail: yinzongxiu@163.com; 2Department of Community Health, Jinan Blood Supply Center, Jinan, Shandong Province, 250001, China). The role of CD8+ T cells in asthma has not been fully discussed. The mechanisms of CD4+ and CD8+ cells in severe asthma (SA) development were compared. The microarray data (GSE31773) was downloaded from the Gene Expression Omnibus (GEO) database, including 20 samples of CD4+ and CD8+ T cells, which were collected from 8 health controls (HC), 4 non-severe asthma (NSA) and 8 SA patients. DEGs of CD4+ and CD8+ T cells in the HC vs. NSA and HC vs. SA groups were identified using the limma package in R. GO and pathway enrichment analysis of the common DEGs between the two groups were analyzed using DAVID. The interactive network of DEGs and significant modules were further explored. In CD4+ cells, there were 168 DEGs in HC vs. NSA group and 685 DEGs in HC vs. SA group, while for CD8+ T cells there were 719 DEGs in the HC vs. NSA groups and 1255 DEGs in the HC vs. SA groups. Besides, 80 common DEGs from CD4+ samples were enriched in the MAPKKK cascade and molecular metabolism, and 385 common DEGs of CD8+ T cells were significantly related with cell apoptosis and transformation. Moreover, two significant modules of DEGs in CD4+ were found to be involved with MPO and BPI. One module of CD8+ T cells containing PDHA1 and MRPL42 was identified to be related with glycolysis. In conclusion, MPO
#Статья представлена на английском языке.
* Эл. почта: yinzongxiu@163.com
and BPI in CD4+, and PDHA1 and MRPL42 in CD8+ T cells might be used as specific biomarkers of SA progression. Therapy targeting the functions of CD4+ and CD8+ T cells may provide a novel perspective for SA treatment.
Keywords: CD+ T cell; severe asthma; differentially expressed gene; interactive network; module analysis. DOI: 10.7868/S0026898415030180
Бронхиальная астма — это хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, которое характеризуется развитием бронхоспазма, отека слизистых оболочек, гиперреактивностью дыхательных путей и гиперсекрецией слизи [1]. При обычной нетяжелой форме астмы (НТА) применяют комбинацию из противовоспалительных и расширяющих бронхи препаратов, тогда как при тяжелой астме (ТА) такие методы неэффективны [2]. В разных странах смертность от астмы варьирует от 0.3 до 17%, ежегодно от этого заболевания погибают около 180000 человек [3]. Астма — это тяжелое бремя для больных, их семей и общества [4]. Механизм развития астмы очень сложен, он до сих пор практически не установлен, поэтому очень важным представляется изучение патогенеза астмы.
Предшествующие исследования были сфокусированы на иммунологической стороне развития астмы. Оказалось, что в развитии астмы принимают участие многие типы клеток иммунной системы — Т-лимфоциты [5], тучные клетки [6] и макрофаги [7], воспалительное микроокружение, создаваемое этими клетками, равно как и структурные клетки дыхательных путей, такие как клетки эпителия [8], эндотелия сосудов [9] и глад-комышечные клетки [10]. Фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF) может ускорять гиперплазию гладкомышечных клеток и клеток стенок кровеносных сосудов, что приводит к сужению просвета дыхательных путей при астме [11]. Обнаружено, что ключевую роль в развитии ТА играют активированные нейтрофилы, которые секретиру-ют множество ферментов, медиаторов воспаления и цитокинов [12]. Доказана важнейшая роль натуральных киллерных СЭ4+ Т-клеток ^КТ) в развитии астмы у человека [13]. СЭ4+ Т-клетки могут способствовать ухудшению течения хронической аллергической астмы за счет выработки интер-лейкина 17 (^-17) [14]. Хелперные Т-клетки второго типа (ТИ2), одна из субпопуляций эффектор-ных СЭ4+ Т-клеток, играют важную роль в терапии ТА [15]. Показано участие трансформирующего фактора роста в (TGF-P), а также ^-5 и ^-8 в ре-моделировании тканей легких при астме [16—18].
Несмотря на подтверждение участия СЭ4+ Т-клеток в развитии воспалительного ответа при астме, о функциях СЭ8+ Т-клеток при этом заболевании известно мало. Показано, что с раз-
витием ТА связана активация CD8+ Т-клеток [19]. Кроме того, CD8+ Т-клетки могут ускорять развитие индуцированного аллергеном гиперответа дыхательных путей и воспаления легких [20].
Анализ изменений экспрессии генов методом гибридизации на микрочипах позволяет определять глобальные изменения в экспрессии генов и идентифицировать гены, важные для развития заболевания. В представленной работе мы использовали анализ на микрочипах для выявления генов, дифференциально экспрессируемых (ДЭГ) в образцах CD4+ и CD8+ Т-клеток, полученных от больных ТА, НТА и от здоровых индивидов (ЗК). Всесторонний биоинформатический анализ использовали для создания сетей взаимодействующих молекул и анализа значимых информатиче-ских модулей с целью получения новой детальной информации о механизмах участия CD4+ и CD8+ Т-клеток в развитии астмы. Этот подход позволил успешно предсказать сеть генов, с наибольшей вероятностью связанных с развитием ТА, а также идентифицировать молекулярные механизмы CD8+ Т-клеток, которые можно использовать для разработки новых подходов к терапии астмы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Данные, полученные с помощью микрочипов Affymetrix. Накопленные научным сообществом данные, получаемые с использованием гибридизации на микрочипах и других высокопроизводительных методов анализа, были архивированы и представлены в базе данных Gene Expression Omnibus (GEO) Национального центра биотехнологической информации (NCBI) [21] — крупнейшего ресурса хранения открытой информации. Мы взяли профили экспрессии генов (GSE31773), полученные Tsitsiou и соавт. [19] на платформе GPL570 [HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array, и добавили их в базу GEO [22]. Нами проанализированы по 20 образцов циркулирующих CD4+ и CD8+ Т-клеток, полученных от восьми здоровых доноров (контроль, ЗК), четырех больных НТА и восьми больных ТА. Образцы CD4+ и CD8+ Т-клеток разделили на две группы: ЗК/НТА и ЗК/ТА соответственно.
Зондам были присвоены названия соответствующих им генов, определенных по результатам аннотации. Вычисляли средние значения
уровней экспрессии каждого гена, а затем переводили их в логарифмическую форму (lg2) для приведения к нормальному распределению [23]. Пакет программ Limma на языке R использовали для выбора генов, дифференциально экспресси-руемых (ДЭГ) в двух группах. В качестве пороговых критериев исключения были выбраны значе-нияp < 0.05 и |кратность изменения log2 (FC)| > 1.5 или |lg2FC| < 1/1.5 (кратность изменения lg2 |FC| > >0.585).
ДЭГ, общие для трех групп. С целью идентификации общих ДЭГ, выявляемых при сравнении ЗК/ТА и НТА/ТА, мы сравнили уровни экспрессии выбранных ДЭГ в образцах ЗК/НТА и ЗК/ТА соответственно, и представили все три набора данных на диаграмме Венна (Venn diagram) [25].
Анализ онтологии (GO) ДЭГ. Анализ GO становится общепринятым при функциональном исследовании бо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.