МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 1, с. 73-79
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.282.22.013
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РОССИЙСКИХ ШТАММОВ STACHYBOTRYS CHARTARUM
© 2004 г. С. Н. Еланский*1, Я. В. Петрунина**, О. И. Лаврова**, А. Н. Лихачев**
*ВНИИ фитопатологии РАСХН, Б. Вяземы **Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Поступила в редакцию 03.12.02 г.
В работе проведен сравнительный анализ штаммов Stachybotrys chartarum, выделенных с техногенных целлюлозосодержащих материалов и с природных субстратов географически удаленных регионов России. Определяли размеры спор, токсичность (тест на Paramecium caudatum) и устойчивость к фунгицидам "Беномил", "Олилен" и "Тилт", а также был проведен ПЦР - анализ структуры генома с помощью праймера, комплиментарного коровой последовательности ретропозона SINE. Установлено, что в выборках из удаленных регионов и с разных субстратов встречаются штаммы, различающиеся по уровню токсичности, устойчивости к фунгицидам и структуре генома. Исследование с помощью ПЦР не выявило связи между структурой генома, группами исследованных признаков и приуроченностью штаммов к территориям или субстратам. Выявленные различия в проявлении комплекса исследованных признаков у групп штаммов из удаленных местообитаний, а также наличие разных типов вегетативной совместимости свидетельствуют о внутривидовом разнообразии S. chartarum в удаленных частях ареала. Отсутствие специфических фено- или генотипи-ческих признаков у штаммов, выделенных с разных субстратов, позволяет говорить о том, что заселение искусственных субстратов происходит, по-видимому, случайными штаммами из природных местообитаний. Популяции на техногенных субстратах представляют собой популяционные волны, не имеющие собственной эволюционной судьбы.
Ключевые слова: Stachybotrys chartarum, биоповреждения, микотоксины, устойчивость к фунгицидам, анализ популяций грибов.
Stachybotrys chartarum (Ehrenberg) S. Hughes - са-протрофный микромицет, в естественных условиях обитающий в почве и на растительных остатках, предпочитая мертвые стебли, листья и семена злаков [1]. Способен вызывать заболевания растений: описаны корневая гниль сои [2], поражения волокон и нераскрывшихся коробочек хлопчатника, стеблей сахарного тростника и фруктовых деревьев [3]. В антропогенной среде гриб переходит на целлюлозосодержащие техногенные субстраты: бумагу, картон, обои, некоторые строительные смеси, деревянные и фанерные конструкции и т.д.
Практическая значимость гриба обусловлена тем, что S. chartarum синтезирует токсины, оказывающие сильное действие на организм человека и животных: роридин Е, сатратоксины F, G, H, триховерролы, триховеррины, веррукарол, вер-рукарин J. Присутствие токсинов отмечено во всех морфологических структурах гриба и в куль-туральной жидкости. Помимо токсинов гриб способен производить иммуносупрессоры (например, циклоспорин) [4, 5] и летучие органические
1 Адресат для корресконденции (e-mail: elansky@yahoo.com).
соединения (1-бутанол, 3-метил-2-бутанол, 3-ме-тил-1-бутанол и тайопсен) [6].
Особую опасность представляет массовое развитие гриба на целлюзосодержащих техногенных субстратах в помещениях (обои, гипсокартон, некоторые шпаклевки и т.д.) после сильных подтоплений. Например, в середине 1990-х гг. были отмечены массовые расстройства здоровья и даже гибель людей в старых зданиях Кливленда, США после наводнения. Причиной этого явилось массовое развитие S. chartarum на нижних этажах зданий [4]. Присутствие спор и газообразных ста-хиботриотоксинов в системах кондиционирования высотных зданий также способно вызвать массовое поражение людей. Неоднократно отмечалась связь между жалобами людей на плохое самочувствие, связанными с качеством воздуха помещений (Indoor Air Quality) и ростом S. chartarum [7, 8].
В популяциях S. chartarum выявлены штаммы, различающиеся гемолитической активностью, содержанием токсинов и структурой генома [9]. Наши исследования [1.10] показали, что штаммы различаются скоростью роста как на питательных средах, так и на образцах техногенных материалов.
Таблица 1. Количество выделенных в чистую культуру изолятов с учетом места выделения и субстрата
Место выделения Субстрат Кодировка Число изолятов Всего выделено
Москва и Московская обл. Штукатурка МШ 6 22
Бумага(картон) МБ 10
Растительные остатки МРО 2
Ткань МТ 2
Воздух МВ 1
Неизвестно МН 1
Томск и пригород Бумага (картон) ТБ 12 23
Растительные остатки ТРО 5
Воздух ТВ 2
Экскременты таракана ТТ 3
Штукатурка ТШ 1
Республика Карачаево-Черкессия Почва КП 4 4
Республика Бурятия Почва БП 4 4
Тверская обл. Растительные остатки ТРО 1 1
Все регионы 54
Целью настоящей работы было выявление вероятных взаимосвязей между приуроченностью штаммов к субстратам, их географическим происхождением и комплексом признаков, включающим морфометрические параметры, токсичность, устойчивость к фунгицидам и структуру генома.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использованы 54 штамма Stachybot-rys chartarum из географически удаленных регионов России: Московская (далее - МО), Томская (далее - ТО), Тверская обл., республики Бурятия и Карачаево-Черкессия. Штаммы выделены из образцов почвы, с растительных остатков и с различных техногенных материалов (табл. 1). Выделение проводили стандартными микробиологическими методами с использованием влажных камер и селективных сред [11, 12]. Все штаммы протестированы на устойчивость к трем фунгицидам ("Беномил", "Олилен", "Тилт") и на токсичность по отношению к Paramecium caudatum Ehrb. Для исследования генома были отобраны 32 изолята из разных местообитаний.
Для определения размеров спор культуры гриба инкубировали в течение 10 сут на агаризован-ной среде на основе пивного сусла. Измеряли длину и ширину 100 спор для каждого изолята. Достоверность сравнения признаков оценивали с помощью программного пакета SPSS 11.5 (независимый T-тест). Выборки считали достоверно различными в случае, если величина критерия T < 0.05.
Для определения токсичности изолятов использовали культуральную жидкость изолятов гриба, выращенных на жидкой среде на основе пивного сусла в течении 10 сут. В качестве тест объекта использовали Paramecium caudatum, которую выращивали на питательной среде (200 мл воды, 10 зерен овса; настаивается несколько сут). На предметное стекло наносили две капли куль-туральной жидкости и одну каплю жидкости с парамециями (все капли - по 50 мкл). Предметные стекла помещали во влажные камеры. Наблюдения за поведением парамеций проводили через 5, 20, 40, 60 мин. Время гибели парамеции служило критерием токсичности культуральной жидкости. Гибель констатировали по полному прекращению движения и распаду простейших [11]. Штамм гриба считали резкотоксичным, если через 5 мин более 70% парамеций были мертвы, токсичным - если гибель отмечалась через 20 мин, слаботоксичным - через 40 мин, нетоксичным - если он не вызывал гибели или каких-либо морфологических изменений у большинства парамеций через 1 ч.
Для исследования чувствительности к фунгицидам после предварительной проверки фунги-цидного действия ряда препаратов [10] были отобраны 3, отличающиеся высокой активностью против S. chartarum и показывающими значительную разницу между чувствительными и устойчивыми изолятами: "Олилен" - системный фунгицид широкого спектра действия против болезней зерновых, "ТИЛТ" - системный фунгицид защитного и лечащего действия, эффективный против грибов,
сравнительный анализ российских штаммов
75
относящихся к аскомицетам, базидиомицетам, а также против несовершенных грибов [13] и "Бе-номил" - системный фунгицид защитного и лечащего действия против мучнистой росы, фузарио-за, церкоспороза [14]. Чувствительность изолятов S. chartarum к фунгицидам оценивали по скорости радиального роста колонии на среде с фунгицидом и без него, как описано в [15]. Изолят считали чувствительным (S), если относительная скорость роста его колонии на среде с фунгицидом (при концентрации действующего вещества 10 мкг/мл) в сравнении с ростом на среде без фунгицида была менее 0.1; слабоустойчивым (SR) - при относительной скорости роста от 0.1 до 0.4; и устойчивым - более 0.4. Тест проводили в 3 повторностях для каждого изолята при оптимальной для роста гриба температуре 25°С [1]. Для оценки достоверности получаемых результатов проводили дополнительный тест по скорости роста на среде с концентрацией фунгицида 1 мкг/мл.
Мицелий для выделения ДНК наращивался в жидкой среде на основе пивного сусла. Через 14 сут инкубации при 25°С мицелий отцеживали из среды, промывали стерильной дистиллированной водой и помещали на сложенную в несколько слоев фильтровальную бумагу для сушки. Около 0.5 мл подсушенного мицелия переносили в предварительно промороженную ступку, заливали жидким азотом и растирали. Растертый мицелий (примерно 0.25 мл) переносили в микропробирку, добавляли 800 мкл. СТАВ-буфера (трис, pH 8.0 - 100 мМ; NaCl - 1.4 M; ЭДТА, pH 8.0 - 20 мМ; CTAB solid -2% (вес/об)), все перемешивали на вортексе, после чего помещали в водяную баню на 1 ч при 65°С. Каждые 20 мин перемешивали на вортексе. Затем добавляли 500 мкл. хлороформа и центрифугировали 10 мин. 700 мкл супернатанта переносили в новую чистую микропробирку, добавляли 400 мкл изопропанола и 1/10 объема CH3COOK (5 М, pH 4.6), перемешивали вручную и центрифугировали 10 мин. Далее сливали супернатант и добавляли 200 мкл охлажденного 70% этанола, ценрифугировали 5 мин, сливали спирт, удаляли его остатки фильтровальной бумагой и высушивали осадок. ДНК ресуспендировали в 50 мкл ТЕ-бу-фера. Для проведения ПЦР использовали 2 мкл.
Реакционная смесь для проведения ПЦР (объемом 20 мкл содержала 10 мМ mpuc-HCl, pH 8.3; 50 мМ KCl; 0.01% Tween 20; по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP ("Silex", Россия); 2 мкМ прай-мера; 5 мМ MgCl2; 20 нг ДНК и 0.1 ед. Taq-поли-меразы ("Silex", Россия). Программа, используемая в термоциклере (в работе использовался термо-циклер Biometra T1, Германия): стадия 1, 1 цикл. 94°С 180 с., стадия 2, 30 циклов: шаг 1 - 94°С 40 с, шаг 2 - 49°С 40 с, шаг 3 - 72°С 90 с; стадия 3, 1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.