БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2012, том 29, № 5, с. 362-366
УДК 576.3
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СИСТЕМ "QUORUM SENSING" У ПСИХРОФИЛЬНЫХ Aliivibrio logei И МЕЗОФИЛЬНЫХ A. fischeri СВЕТЯЩИХСЯ МОРСКИХ БАКТЕРИЙ
© 2012 г. С. А. Хрульнова, И. В. Марышев, А. Д. Куликовский, И. В. Манухов*, Г. Б. Завильгельский
Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов,
117535, Москва, 1-й Дорожный пр., 1; *электронная почта: manukhov@genetika.ru Поступила в редакцию 27.06.2011 г.
Проведен анализ структурных особенностей lux-оперона светящихся психрофильных морских бактерий Aliivibrio logei (изоляты из акваторий Белого и Охотского морей). Определены биолюминесцентные характеристики штаммов и показано, что экспрессия lux-генов регулируется системой "quorum sensing". Регуляция люминесценции по типу "quorum sensing" сохраняется и в клетках Escherichia coli, содержащих клонированный lux-оперон A. logei. Структура lux-оперона A. logei значительно отличается от структуры lux-оперона близкородственного вида мезофильных светящихся морских бактерий A. fischeri. В lux-опероне A. logei отсутствует ген luxI перед геном luxC, а непосредственно за геном luxG расположен фрагмент с генами luxR2—luxI. Сравнение биолюминесцентных характеристик lux-оперонов A. logei и A. fischeri, клонированных в клетках E. mli, показывает, что несмотря на существенные различия в структуре и нуклеотидной последовательности, чувствительность lux-оперонов к аутоиндуктору и время их отклика на появление аутоиндуктора в среде примерно одинакова.
Ключевые слова: Aliivibrio logei, Aliivibrio fischeri, биолюминесценция, lux-оперон.
Впервые светящиеся морские бактерии Aliivibrio logei были охарактеризованы и выделены в особый вид рода Vibrio (нынеAliivibrio [1]) в 1978 г. [2]. По ряду биохимических характеристик бактерии вида A. logei мало отличаются от близкородственных светящихся морских бактерий A. fischeri (декарбоксилирование лизина, восстановление нитрата, а также ферментация ^-галактозы) [3, 4]. Однако бактерии A. logei являются психро-филами (растут при 4° С и не растут при 30° С), в то время как A. fischeri — типичные мезофильные бактерии (не растут при 4°С и растут при 30°С). Сравнительный анализ 16S рРНК у этих видов бактерий показал практически полную их идентичность у A. logei c A. salmonicida и значительные отличия от A. fischeri [3]. В настоящей работе проведен сравнительный анализ систем "quorum sensing" (QS) lux-оперонов у штаммов A. logei, изолированных в акваториях холодных морей (Белого и Охотского) и мезофильных бактерий A. fischeri. Определены структура и нуклеотидная последовательность lux-оперона бактерий A. logei, обнаружены значительные отличия от lux-оперо-на A. fischeri. Показано, что несмотря на существенные различия в структуре и нуклеотидной последовательности lux-оперонов A. logei и A. fis-
cheri, чувствительность к аутоиндуктору (АИ) и время отклика на появление АИ в среде примерно одинаковы у обоих видов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериальные штаммы и плазмиды. E. coli K12 TG-1 F- thi hsdRD5 X(lac-pro)/F'(traD36 proAB+ lacIqZ-M15); E. coli МС1061 F' araD139X(ara leu)769 lacX74galU galKhsdR mcrB rpsL thi. Штаммы A. fischeri MJ-1 и МГУ-6 получены от А.П. Зарубиной (кафедра микробиологии МГУ им М.В. Ломоносова). Штаммы A. logei: BM1, выделен из кишечника керчака Myoxocephalus scorpius (акватория Белого моря); KCh1, выделен из кишечника керчака Myoxocephalus polyacanthocephalus, (Камчатка, акватория Охотского моря).
Плазмида pF1 (вектор pUC19, содержащий фрагмент ДНК с lux-опероном A. fischeri). pVFR1 (вектор pDEW201, содержащий ген luxR и регуля-торную область lux-оперона A. fischeri) является биосенсорной плазмидой: гены luxCDABE Photo-rhabdus luminescens (термостабильная люцифера-за) транскрибируются в присутствии АИ N-3-оксо-гексаноиллактон L-гомосерина. pSV16 аналогична pVFR1, но содержит ген luxR2 и регуляторную об-
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СИСТЕМ "QUORUM SENSING"
ЗбЗ
ласть lux-оперона A. logei KChl. Плазмиды pSV10.4 и pSV20 содержат фрагменты ДНК с lux-оперона-ми штаммов BM1 и KChl A. logei, соответственно, встроенные в вектор pTZ57R.
Среды и условия роста бактерий. Морские светящиеся бактерии растили на среде SWTm, содержащей (%, в./об.): триптон 0.5, дрожжевой экстракт 0.25, морская соль 1.5 и глицерин 0.3. Клетки растили при 15°С.
Бактерии E. coli растили в бульоне Луриа-Бер-тани (LB). Агаризованные среды готовили с 1.5% агаром. Концентрации антибиотиков: ампициллин — 100 мкг/мл, хлорамфеникол — 25 мкг/мл.
Ферменты и реагенты. В работе использовали ферменты фирмы Fermentas MBI (Литва). Субстрат люциферазы н-деканаль и N-3-оксогекса-ноиллактон Z-гомосерина, используемый в качестве АИ (Aldrich Sigma).
Выделение ДНК, рестрикция, лигирование, трансформация. Гибридные плазмиды и векторы выделяли методом щелочной экстракции. Хромосомную ДНК выделяли из клеток на поздней экспоненциальной фазе роста, которые лизиро-вали лизоцимом и SDS, а затем обрабатывали фенолом и переосаждали этанолом. Рестрикцию, лигирование фрагментов ДНК, электрофорез в агарозном геле, выделение фрагментов ДНК из агарозного геля методом электроэлюции, трансформацию кальциевых клеток проводили согласно [5].
Клонирование генов lux-оперона. Нуклеотидные последовательности фрагментов lux-оперона, содержащихся в плазмидах pSV1 и pSV2, полученных ранее [6], оказались высокогомологичными последовательностям lux-оперона A. salmonicida. Исходя из этих данных синтезированы праймеры для клонирования полного lux-оперона из штаммов KCh1 и BM1: VLdir 5'-gcagccttgttttatttgtgcgt-catttttcgg-3', VLrev 5'-gttcaaaagtgtattgcccagagcaaacg-ga-3'. При помощи ПЦР с хромосомной ДНК штаммов KCh1 и BM1 получили фрагменты размером около 11 т.п.н., содержащие полный lux-оперон, которые клонированы в А/Т векторе pTZ57R. Получили плазмиды pSV20 и pSV10.4, содержащие полные lux-опероны штаммов KCh1 и BM1 соответственно.
Определение нуклеотидной последовательности генов 16SрРНК и lux-оперона. ДНК секвени-ровали по Сэнгеру [7].
Для ПЦР-амплификации и секвенирования гена 16S рРНК использовали следующие праймеры: Rev16S 5'-agccggttttgtttctgccctc-3', Dir16S 5'-caavvttggcaatctgtgtgaaca-3'. Секвенирование генов lux-оперона штаммов A. logei проводили в два этапа. На первом этапе секвенировали фрагменты
Оптическая плотность культуры, OD
Рис. 1. Зависимость интенсивности биолюминесценции штаммов КСЫ А. logei и МГУ-6 А. /Ьекеп от плотности культуры клеток.
1000000 г -*-К
й -И-+АИ
° —а— +надосадочная
Я
£ ^
8 ° 100000 -о
и | 10000 -%
2
л
1000 -1-1-1-1
0 50 100 150 200
Время, мин
Рис. 2. Зависимость интенсивности биолюминесценции А. logei ВМ1 от времени инкубации при добавлении в среду АИ или надосадочной жидкости.
ДНК, содержащие консервативные гены 1ихАВ, кодирующие люциферазу, в плазмидах р8У1 и р8У2. На втором этапе после клонирования полных 1их-оперонов штаммов КСЫ и ВМ1 секвенировали остальные гены.
Биолюминесценцию клеток измеряли на люми-нометре LMA01 (Весктап) в кюветах, содержащих 200 мкл препарата, при комнатной температуре. При необходимости к суспензии клеток перед измерением люминесценции добавляли 2—3 мкл субстрата люциферазы — 0.001% спиртового раствора н-деканаля.
Надосадочную жидкость получали центрифугированием стационарной, люминесцирующей культуры А. logei или А. ^екеп с последующей сте-
364
ХРУЛЬНОВА и др.
Pl Pr
lux-оперон —— Aliivibrio fischeri luxR
luxl I luxC I luxD\ luxA I luxB I luxE
lux-оперон _
Aliivibrio logei luxR
Pl Pr
Pl2 Pr2
luxC I luxD I luxA I luxB I luxE |lux^^TuxR2 I— -| luxl
Рис. 3. Структура lux-оперонов A. logei и A. fischeri.
рилизацией с помощью фильтра 0.22 мкМ. Для проверки QS-ответа в среду добавляли 1/10 от объема культуры клеток.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Основные характеристики штаммов: оптимальная температура роста, биохимические параметры, данные по 16S рРНК. Проведено сравнение психрофильных штаммов A. logei BM1 и A. logei KChl по оптимальной температуре роста со штаммами A. fischeri MJ-1 и МГУ-6. Штаммы BM1 и KCh1 A. logei способны к росту при 4°С в отличие от мезофильных бактерий A. fischeri MJ-1 и МГУ-6. Биохимические характеристики (способность к декарбоксилированию лизина, восстановлению нитрата и ферментации .D-галактозы) исследуемых штаммов совпадают с характеристиками штаммов A. fischeri. Сравнили нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК штаммов BM1 и KCh1 (FJ858206) A. logei и штаммов A. logei ATCC2985T и A. fischeri ATCC7744T (стандартные (референсные) штаммы, выбранные согласно [8]). Выявлены значительные различия в нуклео-тидных последовательностях гена 16S рРНК исследуемых штаммов и бактерий A. fischeri, и практически полная идентичность с геном 16S рРНК референсного штамма ATCC2985T A. logei.
Биолюминесцентные характеристики штаммов A. logei; регуляция типа QS. На рис. 1 представлена кривая зависимости интенсивности биолюминесценции штаммов A. logei KCh1 и A. fischeri МГУ-6 от плотности культуры клеток, культивируемой в жидкой среде при 16°С. Резкое увеличение интенсивности люминесценции при достижении культурой A. fischeri OD = 0.3 и культурой A. logei OD = 0.5 свидетельствует о регуляции экспрессии генов lux-оперона по типу QS.
Присутствие в штаммахA. logei BM1 и KCh1 гена luxR, кодирующего белок LuxR — активатор транскрипции lux-оперона, выявляли, внося АИ в среду с бактериями A. logei, выросшими до ранней экспоненциальной фазы (OD = 0.2) при 16°С, и продолжали инкубировать клетки c аэрацией,
измеряя через определенные промежутки времени интенсивность биолюминесценции клеточной суспензии.
На рис. 2 представлена зависимость интенсивности биолюминесценции клеток штамма A. logei BM1 от времени инкубации при добавлении АИ или надосадочной жидкости в среду (для штамма A. logei KChl данные сходны). Видно, что в присутствии АИ бактерии через некоторое время начинают люминесцировать, в то время как контрольные клетки (без добавления АИ) не светятся еще продолжительное время.
Клонирование генов lux-оперона штаммов BM1 и KCh1 в клетках E. саН, сравнение чувствит
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.