УДК 577.114:547.458.88.(062+066):53.088
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИХ МЕТОДИК ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕЛКА В ОБРАЗЦАХ ПЕКТИНОВЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ © 2015 г. С. А. Пономарева*, В. В. Головченко*- #, О. А. Патова*,
Е. В. Ванчикова**, |Ю. С. Оводов|*
*Институт физиологии, Коми НЦУрО РАН, 167982, Сыктывкар, ул. Первомайская, 50 **Институт биологии, Коми НЦ УрО РАН, 167982, Сыктывкар, ул. Коммунистическая, 28 Поступила в редакцию 29.05.2014 г. Принята к печати 30.09.2014 г.
С целью анализа достоверности определения массовой доли белка в образцах пектиновых полисахаридов по оптической плотности растворов в ультрафиолетовой и видимой области спектра, проведено сравнение одиннадцати методик, называемых методами: Флореса, Лоури, Бредфорд, Седма-ка, Руэмана (нингидриновая реакция), ультрафиолетовой спектрофотометрии, с реактивом Бенедикта, с реактивом Несслера, с амидовым черным, с бицинхониновым реактивом, биуретовым методом. В результате выявлена недостаточная чувствительность семи из перечисленных методов, не позволяющая рекомендовать их для этих целей. Методы Лоури, Бредфорд, Седмака и с реактивом Несслера можно использовать для определения содержания белка в образах пектиновых полисахаридов, причем метод Бредфорд может быть рекомендован для характеристики образцов пектиновых полисахаридов, если массовая доля белка в них не превышает 15%, и метод Лоури — для образцов с массовой долей белка более 15%.
Ключевые слова: пектиновые полисахариды, спектрофотометрические методики определения белка, метрологическое исследование, прецизионность, правильность.
Б01: 10.7868/80132342315020116
ВВЕДЕНИЕ
Среди растительных полисахаридов пектины являются наиболее сложными и интересными с точки зрения структурной организации и функциональной активности. Являясь компонентами растительных клеток, они выполняют разнообразные биологические функции в различные периоды роста и развития растений [1, 2]. Пектиновые полисахариды характеризуются широким спектром физиологического действия, проявляя антидотное, гиполипидемическое, иммуномоду-лирующее, противоопухолевое, противовоспалительное, антиоксидантное действие [3—5]. Благодаря своим гелеобразующим свойствам, пектины получили широкое применение в фармацевтической и пищевой промышленности [6, 7]. Они экстрагируются из растительных клеток в виде сложных смесей, состав которых зависит от источника выделения и метода экстракции [3, 7]. Часто вместе с пектиновыми полисахаридами из раститель-
# Автор для связи (тел.: +7 (8212) 24-10-01, факс: +7 (8212) 24-10-01, эл. почта: lemnan@mail.ru).
ного материала экстрагируются белковые компоненты, поскольку они, наряду с полисахаридами и ароматическими соединениями, входят в состав растительной клетки[1, 8, 9]. Массовая доля белка в растущей клетке достигает 5—10% от массы сухого растительного материала [10]. Соотношение белка и пектиновых полисахаридов, со-экстрагирующихся из растительных клеточных стенок, зависит от условий экстракции [8, 11].
Наличие химической связи между молекулами белка и пектинов было установлено методом атомно-силовой микроскопии [12]. Это может быть ковалентная связь через остатки галактозы и арабинозы боковых цепей рамногалактуронана-1 [13, 14]. Отдельные белки, в том числе ферменты, соединены с компонентами клеточной стенки лабильной ионной связью и легко извлекаются совместно с другими биополимерами водой и водными растворами [10]. Ионные связи между полисахаридами и белками могут возникать также в процессе экстракции, например, между аминогруппой щелочных белков (арабиногалактановые белки) и карбоксильной группой пектиновых по-
лисахаридов [14]. Наличие белка в образцах пектиновых полисахаридов и его массовая доля влияют на физиологическую активность [15, 16].
Для определения массовой доли белка в различных биологических объектах используют методы Седмака [17], Флореса [18], Руэмана (нингидрино-вая реакция) [19], биуретовый метод [20], метод ультрафиолетовой спектрофотометрии [21], метод с реактивом Несслера [22], Бенедикта [23], с амидо-вым черным [24] и бицинхониновым реактивом [25, 26]. В образцах пектиновых полисахаридов — чаще всего это методы Лоури [27] и Бредфорд [28].
В данной работе проведено метрологическое исследование четырех методик определения белков в образцах пектиновых полисахаридов спек-трофотометрическим методом и выявлены методики, позволяющие получать результаты измерений с меньшей погрешностью. Установлены диапазоны массовой концентрации белка в растворе, в которых градуировочные функции линейны. С целью оптимизации процесса определения массовой доли белка в образцах пектиновых полисахаридов проведена частичная модификация двух методов — Бредфорд и с реактивом Несслера.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Проведен сравнительный анализ одиннадцати спектрофотометрических методик определения массовой доли белка в различных биологических объектах, называемых методами: Седмака [17], Флореса [18], Руэмана (нингидриновая реакция) [19], биуретовым методом [20], ультрафиолетовой спектрофотометрии [21], с реактивом Несслера [22], Бенедикта [23], с амидовым черным [24] и бицинхониновым реактивом [25, 26], Лоури [27], Бредфорд [28]. Результаты анализа свидетельствуют о том, что методы: в ультрафиолетовой и в видимой области спектра, такие как Флореса, би-уретовый, Руэмана (нингидриновая реакция), с реактивом Бенедикта, с амидовым черным и с бицинхониновым реактивом, — характеризуются хорошей разрешающей способностью, обладают высокой специфичностью, однако нижний предел определения массовой концентрации белка в растворе для них составляет 200 мкг/см3. Ввиду того что пектины имеют ограниченную растворимость в воде — до 100 мкг/см3 [6], данные методы невозможно использовать для определения содержания белка в образцах пектиновых полисахаридов. Установлено, что чувствительность методов Лоури, Бредфорд, Седмака и с реактивом Несслера позволяет использовать их для определения содержания белка в образцах пектиновых полисахаридов.
Метод Лоури сочетает два метода: биуретовый и с реактивом Фолина. Поэтому в процессе развития окраски при взаимодействии белка с реак-
тивами, используемыми в определении массовой доли белка методом Лоури [27], последовательно протекают по меньшей мере две цветные реакции. Одна из них — биуретовая реакция между ионами меди и остатками аминокислот в полипептидной цепи. В образующемся комплексе ион меди связан с четырьмя атомами азота молекулы белка координационными связями и с двумя атомами кислорода — ионными, поскольку в избытке щелочи водород енольной ОН-группы проявляет кислые свойства и способен замещаться на ионы металлов. Полноценный комплекс образуется лишь с пептидами, состоящими более чем из четырех аминокислотных остатков [20], и характеризуется высокой стабильностью. Вторая реакция — это реакция солей додекамолибдофосфорной и додекавольфрамофосфорной кислот, компонентов реактива Фолина, с остатками ароматических аминокислот, главным образом с остатками тирозина, в меньшей степени с остатками триптофана, гистидина и цистеина. Процессы, происходящие при образовании вольфрамового и молибденового синего, до конца не изучены. Полагают, что окрашенные комплексы додекамо-либдофосфорной и додекавольфрамофосфорной кислот формируются не только с остатками ароматических аминокислот, входящими в состав белков, но и с комплексными соединениями меди, образовавшимися в ходе биуретовой реакции при взаимодействии белка со щелочным раствором сульфата меди.
Метод Лоури менее чувствителен, чем метод с реактивом Фолина, но более чувствителен, чем биуретовый метод. Однако метод Лоури менее специфичен, чем биуретовый, поскольку на интенсивность окраски оказывает влияние присутствие примесных соединений с ароматическими группами, например полифенолов, которые могут соэкстрагироваться с пектиновыми полисахаридами. Поэтому метод Лоури, как и метод с реактивом Фолина, не всегда обеспечивает получение точных результатов при определении содержания белка в образцах пектиновых полисахаридов.
В основе методов Седмака [17] и Бредфорд [28] лежит один принцип: связывание сульфогрупп красителя Кумасси G-250 с аминогруппами остатков аргинина и гидрофобных аминокислот, причем с аминогруппами аргинина сульфогруп-пы красителя связываются быстрее, чем с аминогруппами других остатков, поэтому сложно подобрать идентичный исследуемому материалу стандартный образец. Более того, значительное количество красителя адсорбируется на стенках кювет, что также влияет на точность результатов измерений.
Метод Несслера [22] представляет собой спек-трофотометрический метод определения концентрации ионов аммония, основанный на их взаи-
Таблица 1. Диапазон массовых концентраций белка и метрологические характеристики градуировочных функций У = А + Ьхр
Характеристики Метод
градуировочных функций Лоури Бредфорд Седмака Несслера
Длина волны X, нм 750 595 620 и 465 410
Диапазон массовых концентраций белка, от ртщ до ртах включ., мкг/см3 от 10.00 до 100.0 от 5.00 до 50.0 от 10.00 до 100.0 от 10.00 до 100.0
Ь,, см3/мкг 0.00213 0.0174 0.0266 0.00261
£д(Ьх), см3/мкг 0.00004 0.0010 0.0005 0.00004
А 0 0.0299 0.051 0.419 0.1386
5я(А0) 0.0019 0.027 0.026 0.0015
Я 0.9995 0.9935 0.9995 0.9988
№, % 1.9 5.7 1.9 1.5
Ь и А0 — коэффициенты линейной зависимости; £д(А0) — стандартное отклонение значения коэффициента Л0; Яя(Ьх) — стандартное отклонение значения коэффициента Ьх; Я — коэффициент корреляции; № — относительное стандартное отклонение коэффициента Ьх градуировочной зависимости (рассчитанное методом математической статистики).
модействии с тетрайодомеркуратом калия в щелочной среде с образованием нерастворимой в воде соли основания Миллона, переходящей в коллоидную форму при низком содержании ионов аммония. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации ионов аммония в растворе. Определение содержания белка основано на том, что массовая доля азота в большинстве белков практически одинакова и приблизительно равна 16%. Поэтому массовую долю белка в исследуемых образцах рассчитывают, умножая измеренное значен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.