БИОЛОГИЯ МОРЯ, 2005, том 31, № 6, с. 435-442
УДК 577.472 БИОГЕОХИМИЯ
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СУБКЛЕТОЧНОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В ОРГАНАХ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ CRENOMYTILUS GRAYANUS И MODIOLUS MODIOLUS В УСЛОВИЯХ ХРОНИЧЕСКОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ1
© 2005 г. О. В. Подгурская, В. Я. Кавун
Институт биологии моря ДВО РАН, Владивосток 690041 e-mail: olga_pod@mail.ru
Статья принята к печати 15.01.2005 г.
Анализировали распределение Zn, Fe, Ni, Cu, Mn, Cd и Pb по субклеточным фракциям, а также и Cd, Zn и Cu по цитоплазматическим белкам почек и пищеварительной железы двустворчатых моллюсков мидии Грея Crenomytilus grayanus и модиолуса Modiolus modiolus, отобранных из загрязненного района и из условно фоновых районов. Установлено, что в условиях загрязнения степень обогащения металлами выше в органах мидии. Показано, что физиологически важные микроэлементы в органах обоих видов моллюсков из загрязненного района накапливаются преимущественно в цитозоле, тогда как в органах мидий из фоновых районов данные микроэлементы связаны преимущественно с мембранными структурами, а в органах модиолусов - с цитозолем. Свинец в органах митилид со всех станций связан в основном с мембранными структурами. Из почек модиолусов, собранных в загрязненном районе, методом гель-хроматографии выделены металлотионеин-подобные белки, в то время как в почках мидий концентрация этих белков оказалась ниже предела чувствительности метода. Предполагается, что в почках мидий синтез металлотионеин-подобных белков подавлен суммарным действием аккумулированных металлов.
Ключевые слова: мидия, модиолус, тяжелые металлы, субклеточное распределение, металлсвязывающие белки.
Comparison of the subcellular distribution of heavy metals in organs of the bivalves Crenomytilus grayanus and Modiolus modiolus from a chronically polluted area. O. V. Podgurskaya, V. Ya. Kavun (Institute of Marine Biology, Far East Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690041)
The subcellular distribution of Zn, Fe, Ni, Cu, Mn, Cd, and Pb and the cytosolic distribution Cd, Zn, and Cu in the kidney and digestive gland of mytilid bivalves Crenomytilus grayanus and Modiolus modiolus are studied. Mollusks were collected from a chronically polluted site and clean sites in Peter the Great Bay (Sea of Japan). At polluted site, a higher metal enrichment occurred in organs of the mussel C. grayanus. In both bivalve species from polluted site, essential metals were mainly accumulated in the cytosol, while in organs of mussels from background areas essential metals were predominantly sequestered by the membrane structures; and in organs of M. modiolus, by the cytosol. Lead in organs of bivalves from all stations was mainly accumulated in the membrane fraction. Metallothionein-like proteins (MT) were separated by gel-chromatography from the kidney cytosol of M. modiolus inhabiting polluted site. The level of MT in the kidney cytosol of C. grayanus was below the detection limit of this method. MT synthesis in kidney of C. grayanus was suppressed by the combined effect of the accumulated metals. (Biologiya Morya, Vladivostok, 2005, vol. 31, no. 6, pp. 435-442).
Key words: mussel, Modiolus modiolus, heavy metals, subcellular distribution, metal-binding proteins.
Тяжелые металлы (ТМ), накапливаясь в организме гидробионтов, могут вызывать нарушения клеточного метаболизма. Цитотоксичность металлов обусловлена главным образом тремя взаимосвязанными механизмами: усилением перекисного окисления липидов, угнетением митохондриального дыхания и нарушением кальциевого гомеостаза клетки (Аксенова, 2000). Для защиты внутриклеточных структур и биохимических систем от повреждений у двустворчатых моллюсков существует несколько путей регуляции и иммобилизации аккумулированных металлов (Bebianno, Serafim, 1998). Как правило, избыток металлов накапливается в
цитозоле, где они образуют устойчивые комплексы с особыми низкомолекулярными белками (металлотио-неинами), имеющими уникальный аминокислотный состав и высокое сродство к ионам ТМ (Roesijadi, 1992; Isani et al., 2000). Следовательно, субклеточное распределение металлов является показателем эффективности процессов перевода металлов в нетоксичную форму (Wallace et al., 2003).
Большинство работ, анализирующих субклеточное распределение тяжелых металлов и их связывание с цитоплазматическими белками у двустворчатых моллюсков, выполнено в лабораторных условиях (Bebian-
'Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта ДВО РАН (№ 04-3-Г-06-046).
no, Langston, 1991; Kaland et al., 1993; Bebianno, Sera-fim, 1998; Wallace et al., 2003). Однако экспериментальные условия значительно отличаются от природных: концентрация металлов в воде обычно выше их содержания в естественных условиях, не учитывается поступление металлов с пищей и т.д. Поэтому для того, чтобы получить объективную информацию, необходимо исследовать субклеточное распределение металлов в тканях моллюсков, обитающих в естественных условиях с повышенным содержанием ТМ в воде (Giguere et al., 2003). Таких работ немного, причем в дальневосточном регионе они практически не проводились. Отметим также, что в подобных исследованиях обычно анализируют мягкие ткани моллюсков целиком (Mouneyrac et al., 1999; Riveros et al., 2003), пищеварительную железу (Regoli, Orlando, 1994) или жабры, пищеварительную железу и остаточные ткани (Bebianno, Serafim, 2003), не учитывая того, что почки, являясь основным органом выведения металлов, испытывают наибольшее воздействие аккумулированных токсикантов.
Цель нашей работы - провести сравнительный анализ эффективности системы детоксикации ТМ в организме двустворчатых моллюсков мидии Грея Creno-mytilus grayanus (Dunker, 1853) и модиолуса Modiolus modiolus (Linnaeus, 1758) (ранее рассматривался как Modiolus kurilensis Bernard, 1983), обитающих в биотопе, хронически загрязненном ТМ.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Исследовали близкородственные виды двустворчатых моллюсков - Crenomytilus grayanus и Modiolus modiolus, особи которых были собраны в б. Десантной (ст. 1) летом 2002 г. (рис. 1). Эта бухта примыкает к району береговой свалки промышленно-бытовых отходов г. Владивостока (б. Горностай) и из-за свободного стекания фильтрата со свалки в бухту является одним из наиболее загрязненных тяжелыми металлами районов зал. Петра Великого (Шулькин и др., 2002). В б. Десантной мидия Грея и модиолус образуют совместные поселения, хотя обычно эти виды занимают разные биотопы: мидия Грея обитает на твердых, а модиолус на более мягких грунтах (Скарлато, 1981). В качестве контрольных были отобраны мидии из прибрежных вод о-ва Рейнеке (ст. 2) и мо-диолусы из зал. Восток (ст. 3), так как эти районы являются условно фоновыми для Японского моря (Шулькин, 2004).
На каждой станции отбирали по 15 половозрелых особей каждого вида. Длина раковин мидий составляла 10.3 ±
± 0.5 см (ст. 1) и 11.3 ± 0.5 см (ст. 2), модиолусов - 10.5 ± 0.3 см (ст. 1) и 10.9 ± 1.4 см (ст. 3). Глубина в местах сбора животных составляла 5-6 м. Для анализов использовали пищеварительную железу и почки моллюсков - основные органы, осуществляющие накопление, детоксикацию и выведение токсикантов, поступающих в организм. Определяли концентрацию тяжелых металлов в пищеварительной железе и почках 5 экз. моллюсков. Средние значения концентрации металлов и стандартное отклонение вычисляли с помощью пакета программ Excel. Достоверность различий между выборками определяли по критерию Манн-Уитни с использованием пакета программ Statistica.
Органы оставшихся 10 особей объединяли и использовали для анализа субклеточного и цитоплазматического распределения металлов. Одну часть объединенной пробы пищеварительной железы и почек гомогенизировали при 0°С в ручном стеклянном гомогенизаторе с добавлением 0.05 М трис-HCl буфера (рН 7.5), содержащего 0.25 М сахарозы, 0.5 М NaCl и 0.01 М MgCb для стабилизации мембран. Полученный гомогенат разделяли на две части. Каждую часть го-могената центрифугировали (20000g, 1.5 ч, 4°С) для разделения мембранной и цитозольной фракций, в которых определяли содержание тяжелых металлов.
Другую часть объединенной пробы гомогенизировали с добавлением 0.05 М трис-HCl буфера (рН 7.5), гомогенат разделяли на две части. Каждую часть гомогената центрифугировали (20000g, 1.5 ч, 4°С) для получения цитоплазматиче-ской фракции, которую использовали для выделения металл-связывающих белков. Для выделения белков готовили колонку с гелем Sephadex G100 (1.5 х 60 см). Колонку калибровали по стандартным белкам - маркерам (бычий сывороточный альбумин, цитохром С), свободный объем определяли с помощью декстрана голубого. Элюцию белков проводили 0.01 М трис-НС1 буфером (рН 7.5), собирали фракции объемом 3 мл. Известно, что металлотионеины имеют особые оптические свойства: максимум поглощения при длине волны 254 нм за счет образования меркаптидных связей и слабое поглощение при длине волны 280 нм вследствие низкого содержания ароматических аминокислот (Isani et al., 2000). Поэтому оптическую плотность элюата определяли при этих длинах волн на спектрофотометре UV-260. Полученные фракции объединяли по молекулярной массе: фракции с Ve/Vo (где Ve -элюционный объем, Vo - свободный объем), равным 0.8-1.4, соответствуют высокомолекулярным белкам (ВМБ, > 60150 кДа), фракции с Ve/Vo, равным 1.8-2.3, - металлотионе-ин-подобным белкам (МТПБ, к 12 кДа), фракции с Ve/Vo, равным 2.3-3.3, - низкомолекулярным белкам (НМБ, < 4 кДа).
Концентрацию белка (мг/мл пробы) в объединенных фракциях элюата определяли микробиуретовым методом
131°Т' 132-01
Рис. 1. Карта-схема района работ. 1 - б. Десантная, 2 - о-в Рейнеке, 3 - зал. Восток.
(Ytzhaki, Gill, 1964). Полученные данные использовали для определения концентрации металлов во фракциях цитоплаз-матических белков (мкг металла/мг белка).
Исследуемые органы, субклеточные фракции и объединенные фракции элюата высушивали при 85°С и минерализовали азотной кислотой марки ОСЧ. Концентрации металлов (Fe, Zn, Cu, Cd, Mn, Pb, Ni) определяли методом пламенной атомно-абсорбционной спектрофотометрии
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.