МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 2, с. 279-288
ГЕНОМИКА, ^^^^^^^^^^^^^^ ТРАНСКРИПТОМИКА
УДК 577.218
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ТРАНСКРИПТОМОВ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ
РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА MCF-7 И MDA-MB-435 С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТЕХНОЛОГИИ ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОГО
СЕКВЕНИРОВАНИЯ RNA-Seq# © 2015 г. C. H. Wang*, X. J. Gao*, S. Y. Liao, J. X. Feng, B. Luo, L. X. Liu*
Key Laboratory of Functional Protein Research of Guangdong Higher Education Institutes, Institute of Life and Health Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China Поступила в редакцию 09.06.2014 г.
Принята в печать 28.06.2014 г.
Профили транскриптомов клеточных линий рака молочной железы человека MCF-7 и MDA-MB-435 исследовали с использованием технологии высокопроизводительного секвенирования RNA-Seq. Для скрининга дифференциально экспрессирующихся транскриптов использован пакет программ DESeq. Всего выявлено 229 генов со значимо различающейся экспрессией в клетках MDA-MB-435 по сравнению с клетками MCF-7. Аннотирование биологических функций через Базу данных для аннотации, визуализации и интегрированного обнаружения (DAVID v6.7) позволило выявить, что эти 229 дифференциально экспрессирующихся генов главным образом вовлечены в биологические функции, связанные с клеточной адгезией и движением, процессингом и презентацией антигенов (через MHC класса II), гормональным ответом, организацией внеклеточных структур, ремоделированием тканей и регулированием пролиферации клеток. При анализе индивидуальных генов выявлено, что по сравнению с MCF-7 у клеток MDA-MB-435 выше способность к метастазированию, а также к процессингу и презентации антигенов, и снижена способность к гормональному ответу. Двадцать наиболее представленных транскриптов в клетках MDA-MB-435, такие как VIM, TNC и CD74, ассоциируются с высоким метастатическим потенциалом. Помимо генов, которые, как ранее сообщалось, вовлечены в метастазирование и развитие опухолей, вновь идентифицированные в этом исследовании гены могут послужить основой для выработки нового подхода в вопросах диагностики и прогнозирования агрессивного рака молочной железы.
Keywords: MCF-7, MDA-MB-435, RNA-Seq, высокопроизводительное секвенирование, рак молочной железы, метастазы.
TRANSCRIPTOME ANALYSIS OF HUMAN BREAST CANCER CELL LINES MCF-7 AND MDA-MB-435 BY RNA-Seq, by C. H. Wang*, X. J. Gao*, S. G. Liao, J. X. Feng, B. Luo, L. X. Liu* (Key Laboratory of Functional Protein Research of Guangdong Higher Education Institutes, Institute of Life and Health Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China; *E-mail: langxialiu@gmail.com, tliulx@jnu.edu.cn). The transcrip-tomic profiles of human breast cancer cell lines MCF-7 and MDA-MB-435 were investigated using the next-generation RNA sequencing (RNA-Seq). The DESeq package was used to screen the differentially expressed transcripts. A total of229 genes with a significantly differential expression in MDA-MB-435 cells as compared with MCF-7 cells were obtained. Annotation of the biological functions of these genes through the Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID ) v6.7 demonstrated that the 229 differentially expressed genes were mainly implicated in the biological functions related to cell adhesion and motion, antigen processing and presentation (via MHC class II), hormone response, extracellular structure organization, tissue remodeling, and cell proliferation regulation. Analysis of the individual genes demonstrated that MDA-MB-435 cells exhibited a higher tendency to metastasis and antigen processing and presentation, and lower ability to hormone response. Twenty most abundant transcripts in MDA-MB-435 cells, such as VIM, TNC, and CD74, represent its high potential for metastasis. Besides the genes previously reported to be involved in tumor metastasis and development, genes newly identified in this study could provide new clues for the diagnosis and prognosis of aggressive breast cancers.
Keywords: MCF-7 cells, MDA-MB-435 cells, RNA-Seq, tumor metastasis. DOI: 10.7868/S0026898415020159
^ Вклад этих авторов равнозначен.
# Статья представлена авторами на английском языке.
* Эл. почта: langxialiu@gmail.com, tliulx@jnu.edu.cn
Стабильный фенотип и генотип клеточных линий рака молочной железы позволяют использовать эти клетки как эффективную модель для изучения механизмов опухолегенеза и оценки эффективности терапии [1]. Клеточные линии рака молочной железы MCF-7 и MDA-MB-435 общеизвестны и широко используются при изучении роста, регуля-торных механизмов и терапии опухолей молочной железы. Клеточная линия рака молочной железы MCF-7 относится к гормонально активным и получена из плеврального выпота пациента с метастатическим раком молочной железы [2]. Позитивная на рецептор эстрогена клеточная линия MCF-7 с низкой локальной инвазивностью считается практически "неметастатичной" [3] и, как обнаружено, "более дифференцированной" [4]. В то же время клеточная линия MDA-MB-435 высоко агрессивна, для нее характерен высокий метастатический потенциал и значительно более низкий уровень диф-ференцировки [3, 5]. Клеточная линия MDA-MB-435 получена из плеврального выпота пациента с раком молочной железы в конце 1970-х [6] и с тех пор используется как клеточная линия рака молочной железы во многих исследованиях. В течение последнего десятилетия не утихают споры о происхождении человеческих клеток MDA-MB-435: из клеток рака молочной железы или меланомы M14 — из-за перекрестного загрязнения клеточных культур на ранней стадии пролиферации [7]. Чэмберс (Chambers) [8] утверждал, что клеточная линия MDA-MB-435, экспрессирующая как эпителиальные, так и меланоцитные маркеры, — низкодифференцированная опухолевая линия агрессивного рака молочной железы. Многие клеточные линии можно, действительно, рассматривать как линии с "неверной родословной" (''lineage infidelity''). Например, в некоторых сообщениях показано, что опухоли молочной железы могут коэкспрессировать эпителиальные и меланоцитные маркеры [9, 10]. Недавно сообщалось о "неверной родословной" 100 образцов опухолей молочной железы, зачастую экспрессирующих маркеры меланоцитов [11]. Холлестел и Шутт (Hollestelle & Schutte) [12] рассматривали MDA-MB-435 как клеточную линию рака молочной железы базального типа, но не люминального. Совсем недавно Нерлих и Бахмайер (Nerlich & Bachmeier) сообщили о том, что эпителиальные/мам-милярные и меланоцитарные характеристики клеток MDA-MB-435 зависят от плотности клеток [5]. При низкой плотности клеток MDA-MB-435 проявляются их эпителиальные характеристики, а при высокой они экспрессируют маркеры меланоцитов. Это означает, что MDA-MB-435 действительно клеточная линии рака молочной железы эпителиального происхождения [5].
Технология высокопроизводительного секве-нирования RNA-Seq привлекает все больше внимания при широкомасштабных исследованиях
транскриптомов. Ее использование позволяет беспристрастно (гипотетически нейтрально) анализировать экспрессию как известных, так и новых транскриптов с высоким разрешением [13]. Более того, до сих пор не изучен полный профиль тран-скриптома клеток MDA-MB-435. В этом исследовании, используя RNA-Seq, мы сравнили дифференциальные транскриптомы клеток MCF-7 и MDA-MB-435 и получили новые доказательства высокой метастатической активности и других агрессивных особенностей, присущих клеткам MDA-MB-435, а также идентифицировали потенциальные маркеры для прогноза и диагностики рака молочной железы базального типа.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Клеточные линии. Линии клеток рака молочной железы человека,MCF-7 и MDA-MB-435, которые были получены из Центра клеточных ресурсов Института наук о жизни Китайской академии наук (Cell Resource Center, Institute of Life Science, Chinese Academy of Sciences, Шанхай, Китай), культивировали в модифицированной среде (DMEM, "Gibco BRL", США) с 10% телячьей эмбриональной сыворотки (FBS, "PAA Laboratories", Австрия), 1% пенициллин/стрептомицин ("Genom", Китай) при 37°C во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2.
Подготовка образцов РНК. Суммарную РНК экстрагировали из клеточных линий MCF-7 и MDA-MB-435, используя Trizol ("Invitrogen") и колонки RNeasy spin ("Qiagen", Германия). Примеси геномной ДНК удаляли с использованием набора DNA-free kit ("Ambion", США). Полученные образцы РНК проанализировали электрофорезом в ага-розном геле и препараты высокого качества отправили в Шанхайскую биотехнологическую корпора-цияю (Shanghai Biotechnology Corporation, Шанхай, Китай) для конструирования библиотеки секвени-рования на платформе Illumina Genome Analyzer IIx System (single-end sequence). Данные РНК-секвени-рования (RNA-seq) доступны в базе данных Gene Expression Omnibus (номер доступа GSE54122).
Конструирование библиотек для секвенирова-ния. Подготовку библиотек для секвенирования проводили в Шанхайской биотехнологической корпорации (Шанхай, Китай) с использованием набора Illumina's TruSeq RNA Sample Preparation Kit ("Illumina"), как описано ранее [14]. Вкратце: суммарную мРНК обогащали полиA+мРНК с помощью гранул для очистки РНК (RNA Purification Beads, "Illumina"), фрагментировали путем инкубации со смесью Elute-Prime-Fragment Mix для получения вставок 120—200 п.н., транскрибировали в кДНК с помощью обратной транскриптазы SuperScript II Reverse Transcriptase ("Invitrogen") и получали двухцепочечные продукты с использованием набора Second Strand Master Mix ("Invitrogen"). По-
сле этого дцДНК обогащали с помощью Ampure XP Beads("Beckman Coulter", Китай), лигировали адапторы по поли(А) и амплифицировали 12-цик-ловой ПЦР. Количественный анализ библиотек проводили на флуориметре Qubit® 2.0 ("Invitrogen") и валидировали, используя биоанализатор Agilent 2 100 ("Agilent", Китай). Кластеры продуцировали с помощью Illuminac Bot для библиотеки в концентрации 10 пМ.
Анализ последовательностей. Необработанные чтения картировали по референс-последо-вательности мРНК человека (RefSeq) для GRCh37/hg19, загруженной с браузера UCSC Genome (http://hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads, доступен с 21.01.2013), используя к
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.