Таблица 1. Результаты ПЦР-анализа суммарной ДНК из разных слоев данных осадков со ст. Посольская банка и количество полученных клонов
Глубина, см Бактериальные праймеры Цианобакте-риальные праймеры Архебакте-риальные праймеры
1-3 + + +
99 клонов 42 клона 54 клона
357-359 + - -
56 клонов
ном склоне Посольской банки на глубине 200 м, на значительном удалении от ее вершины. Отбор керна осуществлялся таким образом, чтобы не захватить склоновую поверхность, где выявляются оползневые тела. Длина отобранного керна составила 360 см. Для контроля целостности слоев проводился литологический и диатомовый анализы с шагом 1-2 см. Керн после поднятия вскрывали за максимально короткий промежуток времени. Внутренняя часть из одной его половины помещалась в стерильные пакеты и затем в жидкий азот до момента проведения молекулярно-биологиче-ских работ в лабораторных условиях. Выделение ДНК, условия амплификации, клонирования и се-квенирования описаны ранее [9]. Последовательности отправлены в GenBank и им присвоены следующие номера: AY839107-AY839135, AY833517-AY8333524, DQ178146-DQ178162. Вторую половину керна использовали для исследования физико-химических характеристик и на диатомовый анализ. Возраст исследуемого керна оценивали по составу доминирующего комплекса водорослей.
Праймеры, использованные в исследовании. В
работе были использованы следующие праймеры, комплементарные участкам гена 16S рРНК: бактерий - 500 L-CGTGCCAGCAGCCGCGGTAA, 1350 R-GACGGGCGGTGTGTACAAG [10], архей -Аг20 F-TCCCGGTTGATCCYGCCRG, Аг958 R-YC-CGGCGTTGAMTCCAATT [11], цианобактерий -CYA 106 F-CGGACGGGTGAGTAACGCGTGA, CYA 781 Ra-GACTACTGGGGTATCTAATC-СС(А/Т)ТТ [8].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Донные отложения, отобранные на ст. Посольская банка состояли из голоценовых осадков, богатых створками диатомей и бедных ими плейстоценовых глин (рис. 1). В голоценовых отложениях исследуемого района видовой состав диатомовых водорослей в основном аналогичен таковому современной диатомовой флоры. Распределение створок
доминирующих видов в толще осадков близко к типичному, наблюдаемому при спокойном осадкона-коплении. Это подтверждается определенной закономерностью в соотношении доминирующих видов: в верхних слоях осадков выделяются слои с доминированием видов родов Aulacoseira и Сус1о-tella, ниже - СусШе11а, а еще глубже - слои с преобладанием СусШеПа, Aulacoseira, Stephanodiscus, Synedra. Плейстоценовые осадки содержали небольшое количество створок диатомей (рис. 1), заметный пик в развитии диатомовых водорослей отмечался в конце плейстоцена на глубине осадка 120 см, по времени совпадающий с кратковременным потеплением Беллинг.
Клетки, детектируемые с использованием красителя DAPI, наблюдались во всех слоях исследуемого керна. Их численность составила в поверхностном слое донных осадков 42.5 ± 2.1 млн. кл/г влажного грунта, в слое 357-359 см - 13.8 ± 0.7 млн. кл/г.
Из этих же слоев осадка была выделена суммарная ДНК, которая была амплифицирована с различными праймерами. Результаты ПЦР-анализа приведены в табл. 1.
Продукты полимеразной цепной реакции были получены не для всех типов используемых прайме-ров. С ДНК из поверхностного слоя донных осадков положительный результат достигнут с бактериальными, архе- и цианобактериальными праймерами. Для ДНК из глубинного горизонта ПЦР-продукты получены только с использованием бактериальных праймеров. Во всех других случаях результат ПЦР-анализа был отрицательным, хотя были использованы различные условия реакции.
Филогенетический анализ полученных последовательностей из различных горизонтов показал, что состав микробного сообщества в поверхностных и глубинных осадках существенно различается (рис. 2-6). Процент сходства варьировал от 87 до 99%.
Последовательности, полученные из поверхностного слоя осадков с использованием бактериальных праймеров, отнесены к следующим филогенетическим группам: зеленые несерные бактерии, 5-про-теобактерии, Р-протеобактерии (№№^ркае), а-про-теобактерии (таб. 2). Несколько последовательностей ^839122, AY839108, AY839115-AY839119) имеют неопределенное положение, поскольку их ближайшими гомологами являются некультивируе-мые бактерии, филогенетическое положение которых остается не ясным (рис. 2). Ближайшие гомологи найдены в почвах Индии, осадках различных озер и океанов, гидротермальных источниках.
Следует отметить более бедный видовой состав микроорганизмов в осадках, сформированных в плейстоцене. Последовательности, полу-
30 15
VER 01-01.St. 1 GC 2 Плейстоцен
Aulacoseira baicalensis
A. islandica + споры
C. baicalensis
сиюооооооооооооосюосюоооосюооооога -1-1-1-1-
■s
о
р3
Stephanodiscus meyerii
Synedra acus et var.
St. flabellatus
80 40 0
Бентос
50
100 150 200
Глубина, см
250
300
350
Рис. 1. Распределение створок диатомовых водорослей (млн. створок на 1 г сухого осадка) в осадках оз. Байкал (VER01-01, St. 1 вС-2).
ченные из ДНК глубоководного осадка, имели наибольшее сходство с последовательностями рода Pseudomonas (95-97%). Они образовывали отдельный кластер на филогенетическом дереве (рис. 3). Нами уже отмечалось наличие последовательностей, близких роду Pseudomonas, в глубоководных осадках, содержащих газовые гидраты
[9], но эти последовательности не были идентичными. Ближайшие гомологи байкальских последовательностей были обнаружены в арктических льдах, колонке древнего льда Китая и в различных водных образцах. Как мы упоминали выше, исследованный горизонт байкальского осадка, который был сформирован в холодный период,
0
0
сравнительный молекулярный анализ микробного сообщества
119
к
-AY839107 1-3 22
-AY093456 некультивируемая бактерия
- AY093480 некультивируемая бактерия
- AF424387 некультивируемая CЫoroflexi
- AF005748 некультивируемая эубактерия
-AF424388 некультивируемая Chloroflexi —^ - AF333546 некультивируемая бактерия
- AY289463 некультивируемая почвенная бактерия
- AY839122 1-3 С
А1390478 почвенная бактерия AY345494 неидент. бактерия
-AY839108 1-3 23
А1536836 некультивируемая бактерия — А1290985 некультивируемая бактерия - AY839119 1-3 13
AF500007 Planococcus maritmus AY422985 BacШus sp. АВ111938 Bacillus halmapalus - AF317743 неидент. бактерия
3
о
- и49429 сульфатредуцирующая бактерия
-AY083025 некультивируемая 5-протеобактерия
■ AF407700 некультивируемая бактерия — AY326580 некультивируемая почвенная бактерия -А1316024 некультивируемая Desulfomonile sp.
- AF254393 некультивируемая бактерия ,- AY839110 1-3 3
К
К &
о н м
л ю о о н
о &
- AY839111 1-3 16
-AY839115 1-3 24
-AY839116 1-3 19
-AY839118 1-3 21
-AY839117 1-3 17
- AY221033 некультивируемая бактерия AY221061 некультивируемая бактерия AF424199 некультивируемая 5-протеобактерия
AF507714 некультивируемая почвенная бактерия
-AY839109 1-3 25 0
Я &
о н м
л ю о о н
о &
-г
А.ГО01344 звездоподобные колонии AY315166 ледниковая бактерия FXS2
- AY839120 1-3 5
-AY839121 1-3 2
-А1518776 некультивируемая а-протеобактерия
■ AY187914 некультивируемая бактерия -AY839114 1-3 20
- АВ116391 некультивируемая бактерия
-AF320959S2 некультивируемая бактерия оз. Мичиган
А1534688 некультивируемая Nitrospirae AY423575 некультивируемая бактерия AF286037 солончаковый клон LCP-6 ,-AY839112 1-3 8
1-AY839113 1-3 6 ^
К
К &
о н м
л ю о о н
о &
л к & ы
к « &
К £ « м
к ю
о
ч
о
ш
М83548 Aquifex pyrophilus
Рис. 2. Филогенетическое положение байкальских бактерий, полученных из осадков оз. Байкал, ст. Посольская банка, 1-3 см.
10 %
100
97
77
86
-AY839127 357 13
AY839130 357 12 -AY839129 357 17
77
-AY839128 357 19 — AY839126 357 18 -AY839125 357 25
AY839131 357 11
74
97 96
A
AY839123 357 7 — AY839123 357 24 AJ431228 протеобактерия BHI80-8
99
AJ551129 Psychrobacter sp. es9 AF374472 Pseudomonas costantinii AF468404 бактерия из арктического льда 1001-AY839134 357 21
ч
-AY321382 некультивируемая бактерия
100 I-AY839133 357 22
A
AF509580 некультивируемая а-протеобактерия 100 г L07834 Geobacter metallireducens
100 | I-AY013609 некультивируемая бактерия Banisveld
AY839132 357 14
AF328183 некультивируемая бактерия AY839135 357 15
79
88
88
■ AF280847 некультивируемая бактерия mle1-! -AF316767 некультивируемая Crater Lake
AJ507298 Vulcanithermus mediatlanticus -Z70246 Pyrococcus abyssi
Рис. 3. Филогенетическое положение байкальских бактерий, полученных из осадков оз. Байкал, ст. Посольская банка, 357-359 см.
практически не содержал створок диатомовых водорослей (рис. 1).
Анализ клонов, полученных из голоценовых осадков, с помощью праймеров архей показал невысокую степень сходства с последовательностями поисковой программы BLASTN Genebank (табл. 2). Эти последовательности показывают наиболее высокий процент сходства с последовательностями, полученными для глубоководных осадков и горячих источников. Семь последовательностей отнесено к группе Crenarchaeota, входящих в кластер некультивируемых Crenarchaeota. Шесть последовательностей отнесены к группе Euryarcraeota. Четыре из них образуют отдельно лежащий кластер на филогенетическом дереве (рис. 4). Данный кластер занимает промежуточное положение между кластерами ANME-1 и ANME-2, представители которых участвуют в анаэробном окислении метана [12]. При более подробном анализе таксономического положения клон 54 был отнесен к кластеру некультивируемых Methanosaeta (рис. 5), участвующих в синтезе метана [13]. Процент гомологии составил 98%.
С помощью специфичных для цианобактерий праймеров получена библиотека из 42 клонов, 14 из которых на настоящий момент проанализиро-
вано. Две последовательности представлены двумя и тремя клонами. Одна последовательность (24) имеет 99% сходства с Synechococcus sp. (Су-апоЬайейа). Представители этого рода также широко распространены в оз. Байкал [14]. Они детектировались в водной толще озера ранее с помощью морфологических характеристик, а также по данным анализа гена 16S рРНК. Учитывая небольшие глубины в районе Посольской банки (около 200 м), появление планктонных видов, в том числе и цианобактерий, в ДНК из поверхностных донных отложений не удивительно. По
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.