МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 3, с. 429-436
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА =
УДК 578.821
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ РЕСТРНКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОМОВ ШТАММОВ ВИРУСА НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ ИЗ РОССИЙСКОЙ КОЛЛЕКЦИИ
© 2004 г. И. Н. Бабкина, И. В. Бабкин, С. С. Маренникова, Л. С. Сандахчиев, С. Н. Щелкунов*
Институт молекулярной биологии, Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Министерства здравоохранения Российской Федерации, Колъцово, Новосибирская обл., 630559
Поступила в редакцию 30.10.2003 г.
Впервые проведен сравнительный анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов двадцати ампликонов, покрывающих в сумме полные геномы 21 штамма вируса натуральной оспы (ВНО) Российской коллекции. Ампликоны были получены с помощью длинной полимеразной цепной реакции. Создана база данных, которая может быть использована как референс-система для идентификации штаммов ВНО. Выполнено сравнительное исследование ДНК штаммов ВНО, имеющих различное географическое происхождение. Наибольшие различия между штаммами сосредоточены в вариабельных концевых районах геномов. На всех построенных дендрограммах присутствуют три группы штаммов ВНО: африканские, азиатские изоляты и штаммы ВНО а^Шш. Штаммы а^Шш демонстрируют наибольшие отличия от остальных штаммов ВНО. Штаммы ВНО, выделенные от больных во время завозной вспышки натуральной оспы в Москве (1960 г.), входят в группу азиатских изолятов ВНО. Впервые выявлен полиморфизм штаммов ВНО внутри одной численно малой вспышки натуральной оспы.
Ключевые слова: вирус натуральной оспы, геном, полиморфизм длины рестрикционных фрагментов, филогенетический анализ.
В настоящее время по общепринятой классификации штаммы вируса натуральной оспы (ВНО) разделяют на два эпидемиологических типа: вирусы большой оспы (variola major) с летальностью во время вспышки заболевания натуральной оспой от 5 до 40% и вирусы малой оспы (variola minor) с летальностью менее 2% [1, 2]. Малую оспу в Южной Америке принято называть alastrim в отличие от Африки, где за ней сохранилось наименование variola minor. Различий в клиническом течении заболеваний, вызванных вирусами variola minor и alastrim, не установлено. Однако лабораторные исследования выявили четкие отличия вирусов alastrim как от вирусов variola major, так и от африканских изолятов variola minor, в структуре ДНК и по таким биологическим тестам, как предельная температура размножения вируса на хорионаллантоисной оболочке куриных эмбрионов и гемадсорбция при 40°С [3]. Проведенный анализ нуклеотидных последовательностей геномов различных изолятов ВНО показал, что африканские штаммы variola major и variola minor не имеют существенных отличий от
Принятые сокращения: ВНО - вирус натуральной оспы; ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов; ДПЦР - длинная полимеразная цепная реакция.
*Эл. почта: snshchel@vector.nsc.ru
азиатских штаммов variola major [4]. В то же время, удалось обнаружить принципиальные отличия в структуре ДНК генома вируса alastrim от других подтипов ВНО [5].
Дифференциация и идентификация штаммов ВНО могут быть достигнуты при использовании методов, основанных на различиях в нуклеотидных последовательностях: рестрикционное картирование геномных ДНК [6-8], секвенирование [9, 10], анализ полиморфизма длины амплифика-ционных фрагментов [11, 12] и полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) [13]. В настоящее время проведение секвенирования и рестрикционного картирования геномов ВНО требует получения большого количества высоко-очищенной ДНК, наличия специального оборудования и длительного времени. Сложность анализа генома ВНО обусловлена его большим размером. Исследование полиморфизма длины амплифика-ционных фрагментов позволяет выявлять отличия только в небольшой части генома. ПДРФ-анализ обеспечивает более высокий уровень специфичности и совместно с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет исследовать полный геном ВНО, затрачивая при этом небольшие количества вирусной ДНК.
Таблица 1. Штаммы вирусов натуральной оспы из Российской коллекции, использованные в работе
Географический район выделения штамма Страна выделения штамма Наименование штамма Год выделения Способ хранения
лиофильно высушенная культура клинические образцы (корочки кожных поражений)
Африка Конго Congo-2 1970 +
Африка Конго Congo-9 1970 +
Африка Руанда Rw-18 1970 +
Африка Танзания 13/62 1962 +
Африка Танзания 22/62 1962 +
Африка Танзания Helder 1962 +
Гвропа Великобритания Butler 1952 +
Ю. Америка Бразилия Brazil-128 +
Ю. Америка Бразилия Brazil-131 +
Азия Индия Ind-3a 1967 +
Азия Индия Ind-4a 1967 +
Азия Индия India-71 1975 +
Азия/Европа Россия M-A-60 1960* +
Азия/Европа Россия M-Abr-60 1960* +
Азия/Европа Россия M-Bl-60 1960* +
Азия/Европа Россия M-Gavr-60 1960* +
Азия/Европа Россия M-Sur-60 1960* +
Азия/Европа Россия M-N-60 1960* +
Азия Пакистан 6/58 1958 +
Азия Пакистан Taj-Barin 1970 +
Азия Пакистан Wzim-Ahmed 1970 +
* Штаммы, выделенные во время завозной вспышки натуральной оспы в Москве [18].
Цель данной работы - проведение сравнительного рестрикционного анализа продуктов (амп-ликонов) длинной полимеразной цепной реакции (ДПЦР) полных геномов штаммов ВНО из Российской коллекции. Для проведения ПДРФ-ана-лиза амплификацию перекрывающихся амплико-нов, в совокупности охватывающих полный геном, выполняли с помощью ДПЦР. В ходе исследования разработан метод идентификации штаммов ВНО и впервые проведено филогенетическое исследование штаммов ВНО из Российской коллекции.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Штаммы ВНО и выделение вирусной ДНК.
Штаммы вирусов натуральной оспы из Российской коллекции (ГНЦ ВБ "Вектор"), использованные в работе, приведены в табл. 1. Культивирование вирусов проводили, как описано ранее [14]. Вирусную ДНК выделяли из цитоплазмы инфицированных клеток Vero согласно [15]. Все вышеописанные работы проводили в специальной
лаборатории ГНЦ ВБ "Вектор", сертифицированной Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) и Министерством здравоохранения Российской Федерации для работы с ВНО. Опыты с неинфекционной ДНК проводили в условиях лаборатории 2-го уровня биобезопасности. Исследования, описанные в статье, одобрены ВОЗ как часть международной программы по изучению ВНО.
Олигонуклеотидные праймеры для ДПЦР
синтезированы на автоматическом синтезаторе ABI-394 ("Applied Biosystems", США) в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск). Нуклеотидные последовательности 20 пар праймеров, соответствующие им расчетные длины амплификационных продуктов и локализация их на геноме для штамма Бангладеш-1975 (GenBank#L22579) представлены в табл. 2. Следует подчеркнуть, что прямой (5'-3') праймер ампликона № 19 и обратный (3'-5') праймер ампликона № 20 (рис. 1) комплементарны консервативным районам, расположенным в
сравнительный рестрикционныи анализ геномов
Таблица 2. Нуклеотидная последовательность праймеров и их локализация на геноме ВНО
431
Номер амп-ли-кона Последовательность праймеров Локализация на геноме ВНО штамм Бангладеш-1975 Длина продукта для штамма Банг-ладеш-1975 (п.н.)
1. (5 -3' 5'талсаатлтатлттатлалтастстслтаатт3' 2697 10200
(3 -5' 5'тстлсстаалтлслаллласллллллтааа3' 12897
2. (5 -3' 5'таалслтттллсллтсталслсатааат3' 12468 12740
(3 -5' 5'тсллталттааллтлллстллслсслалсал3' 25208
3. (5 -3' 5'тсссллттслалллтсллтстлтстасалс3' 24571 11876
(3 -5') 5'лсллаасллллаталтааалсатслтллт3' 36447
4. (5 -3') 5'таслслтлллсстстааслсттлтттсататл3' 35663 11476
(3 -5') 5'ааслтаассллтлстлсатттслсаттллтл3' 47139
5. (5 -3') 5'тасттсатллллтатлаатстталлссллл3' 45088 9954
(3 -5') 5'лтттллтасаааллстлатсатслсслл3' 55042
6. (5 -3') 5'ласаалтасааатттсатлсатлалт3' 53455 11536
(3 -5') 5'лалааттаслстаттллаттлсатталааттст3' 64991
7. (5 -3') 5'салллллллтслттлллаалтатлстсаттлат3' 64915 7533
(3 -5') 5'ллстлтттттссттсатттасслтлсас3' 72448
8. (5 -3') 5'сслатлтстсттллсалтаттсттсаслалта3' 71702 12985
(3 -5') 5' ттттт аат алт ааллалаалалт лт аалстт т 3' 84687
9. (5 -3') 5'слллллтлтлллалллтслтсслслалттссл3' 84278 9372
(3 -5') 5'сллсластттттллтатслллааатллллсл3' 93650
10. (5 -3') 5'тааататластлталлсттатттллталталлт3' 92413 7182
(3 -5') 5'талллслттасслаллсттллтстатстстлаат3' 99595
11. (5 -3') 5'слслтссттссллаллаллалсттлатллсаал3' 99007 10302
(3 -5') 5'ааслаалаатлаллсалассстлтлтстсл3' 109309
12. (5 -3') 5'ттллслсслттсссасатслалтталлтл3' 107519 15643
(3 -5') 5' ааалт лс аалааллллс алаллс ат алл3' 123162
13. (5 -3') 5'лталсаслттласслсаттслстатллл3' 122878 9838
(3 -5') 5'таатлалтлллссалссалаттлллааллл3' 132716
14. (5 -3') 5'тсттсатттлттлссатлссталлстлллсаст3' 132626 11789
(3 -5') 5'стсслслсастллтстсталтслтттттталл3' 144415
15. (5 -3') 5' с алаалт ат ллт тсслт лааслат сслаллл3' 144283 15549
(3 -5') 5'тстссаллтаталлаттлассатлтлсллслл3' 159832
16. (5 -3') 5'лтттатлслтсаласлтссатлтассл3' 159748 4431
(3 -5') 5'лслтсттстлтаатллтллттсслаататсса3' 164179
17. (5 -3') 5'тааалатллласлтлтллсатллсс3' 164280 9048
(3 -5') 5'лстсстатллтлассалтас3' 173328
18. (5 -3') 5'ласассатсслтттт лллас ллт ат 3' 172810 10990
(3 -5') 5'асслаалсалтлтлттатттслталттастл3' 183800
19. (5 -3') 5' ататс тлалллллллт ататалсс3' 66 2690
(3 -5') 5'лстлслтасталслтстллтасс3' 2734
20. (5 -3') 5'лссллтастсллалстлсалллс3' 183549 2496
(3 -5') 5' ататс тлалллллллт ататалсс3' 186022
10 30 50 70 90 110 130 150 170 т.п.н.
—I-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1—
1 3 5 7 9 11 13 15 17 20
19 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Рис. 1. Схема расположения ампликонов на геноме ВНО штамм Бангладеш-1975. Двунаправленными стрелками обозначены соответствующие ампликоны, цифрами над ними - порядковые номера ампликонов (см. табл. 2). В верхней строке приведены координаты на геноме в т.п.н.
непосредственной близости к концевым шпилькам ДНК ВНО.
ДПЦР проводили с использованием набора XL PCR Kit ("Applied Biosystems", США) в 50 мкл смеси в тонкостенных микропробирках объемом 0.2 мл ("Applied Biosystems", США). Каждая реакционная смесь содержала следующие компоненты:
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.