БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2014, том 31, № 2, с. 88-94
УДК 577.336
СТАБИЛИЗАЦИЯ NADH-ДЕГИДРОГЕНАЗЫ В МИТОХОНДРИЯХ
АДЕНОЗИНФОСФАТАМИ
© 2014 г. М. С. Фролова, Н. Л. Векшин*
Институт биофизики клетки РАН, 142290,Московская обл., Пущино, ул. Институтская, 3;
* электронная почта: nvekshin@rambler.ru Поступила в редакцию 14.06.2013 г.
Как известно, многие митохондриальные энцефаломиопатии, например болезнь Паркинсона, вызваны повреждением NADH-дегидрогеназы. Мы предполагаем, что это может быть связано с утратой флавинмононуклеотида (FMN) — кофермента NADH-дегидрогеназы. Ранее в нашей лаборатории было показано, что в результате различных воздействий изолированные митохондрии легко утрачивают FMN из активного центра фермента. Этот процесс блокировался субстратом фермента — NADH и продуктом реакции — NAD. В данной работе с помощью флуоресцентной спектроскопии и фотоколориметрии мы протестировали ряд природных аналогов NAD на способность стабилизировать флавин NADH-дегидрогеназы в митохондриях из печени крысы. Оказалось, что лучше всего, наряду с NAD и NADH, препятствуют выходу FMN в раствор такие производные аденина, как ATP, ADP и AMP. Аденин, аденозин, а также NADPH, никотиновая кислота и никотинамид не предотвращают этот процесс. Полученные данные могут быть использованы при разработке синтетических препаратов, аналогичных аденозинфосфатам, для лечения и профилактики митохондри-альных заболеваний.
Ключевые слова: МАВЫ-дегидрогеназа, митохондрии, энцефаломиопатии, болезнь Паркинсона, митохондриальные болезни, флуоресцентная спектроскопия, флавиновая флуоресценция, старение митохондрий, аденозинфосфаты.
Б01: 10.7868/80233475514010046
В последние годы старческое развитие нейро-мышечных дегенеративных заболеваний все чаще связывают с нарушениями работы МАЭЫ-дегидро-геназного комплекса I в митохондриях [1, 2] и, как следствие, повышенным окислительным стрессом клеток. Мы предполагаем, что одним из факторов, вызывающих эти нарушения, является потеря связи между БММ и МАЭЫ-дегидрогеназой.
БММ находится в 50-кДа субъединице МАЭЫ-дегидрогеназы (именно эта субъединица имеет активный центр для связывания МАЭЫ). БММ связан с ферментом нековалентно и поэтому при различных воздействиях легко выпадает. Это может происходить спонтанно с течением времени, при небольшом повышении температуры, под действием следовых количеств (0.001%) детергентов и других вредных факторов [3, 4]. В результате электроны от МАЭЫ не идут далее по электрон-транспортной цепи, а напрямую восстанавливают молекулярный кислород до супероксида. Перепроизводство супероксид-аниона, способного приводить к перекисному окислению липидов, к повреждению белков и ДНК, вызывает неизбежное старение как самих митохондрий, так и других клеточных органелл. В ходе этого процесса
может запускаться гибель клетки путем апоптоза или некроза, в зависимости от степени повреждения митохондрий.
Ранее в нашей лаборатории было показано, что предотвратить потерю связи между NADH-дегидрогеназой и молекулой FMN можно с помощью NAD, который стабилизирует фермент [3, 4]. Такое действие NAD вызвано, во-первых, тем, что он, являясь продуктом окисления NADH, ин-гибирует реакцию дегидрирования, и, во-вторых, находясь в активном центре, механически стабилизирует активный центр, что препятствует высвобождению FMN. К сожалению, возможное лечение митохондриальных энцефаломиопатий с использованием NAD затруднительно, так как он плохо проникает в клетки и в сами митохондрии. Кроме того, NAD может тормозить работу NADH-дегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы и других NAD-зависимых ферментов.
Задача данной работы заключалась в тестировании некоторых природных аналогов NAD на предмет стабилизации FMN в NADH-дегидроге-назе митохондрий, причем, что особенно важно, без подавления ферментативной активности. Для
этого был выбран ряд веществ с похожей на NAD химической формулой: АТР, ADP, АМР, аденин, аденозин, никотиновая кислота и никотинамид.
Чтобы ускорить спонтанный выход FMN, изолированные митохондрии инкубировали при температуре 37°С в течение 2 ч. Для того чтобы такие вещества, как NAD, NADH, аденин и аденозин, лучше проникали в митохондрии, а ФМН лучше выходил из митохондрий, была выбрана гипотоническая среда инкубации, содержащая 100 мМ сахарозу и 10 мМ трис-фосфат (рН 7.0). В такой среде митохондриальные мембраны становятся более проницаемыми. Кроме того, митохондрии использовали после однократной заморозки, которая способствует некоторой пермеа-билизации мембран и лучшему проникновению веществ (но не разрушает самих органелл).
Для определения ферментативной активности NADH-дегидрогеназы был выбран фотометрический метод Беляковича с помощью пара-нитро-тетразолия фиолетового (p-NTV), восстанавливающегося до формазана [5]. Этот метод удобен тем, что скорость восстановления p-NTV в десятки раз превосходит скорость передачи электронов по электрон-транспортной цепи на кислород, поэтому можно не использовать блокаторы дыхательной цепи.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Митохондриальную фракцию из печени крыс выделяли в среде, содержащей 20 мМ трис-HCl и 250 мМ сахарозу (рН 7.7), при температуре 2°С стандартным методом с некоторыми модификациями [6]. Сначала центрифугировали исходную общую суспензию на BECKMAN J2-21 при 1000 g в течение 10—15 мин, в результате чего осаждались (и затем отбрасывались) клетки и другие крупные частицы. Супернатант центрифугировали в течение 15 мин при 5000 g, в результате чего осаждались в основном зрелые тяжелые митохондрии, которые затем суспендировали в той же среде (9 мл на 1.5 мл осадка), расфасовывали на льду в пробирки Eppendorf по 1 мл, замораживали и далее использовали для опытов (после размораживания). В ряде случаев выделение митохондрий производили в среде, содержащей 200 мМ сахарозу, 100 мМ маннит, 10 мМ HEPES (рН 7.5), и осуществляли двойную промывку с двукратным центрифугированием при 5000 g.
Ферментативная реакция окисления NADH пара-нитротетразолием фиолетовым (p-NTV) детектировалась по образованию формазана, откладывающегося внутри митохондрий. В ходе ферментативной реакции окисления NADH молекула p-NTV восстанавливается до формазана, и суспензия митохондрий приобретает поэтому розовую окраску. В этих опытах к суспензии мито-
хондрий из печени крысы добавляли 100 мкМ NADH, 100 мкМ p-NTV и тестируемое вещество (ADP, аденозин и др.) в избытке (до 300 мкМ). Кинетику увеличения оптической плотности при образовании формазана измеряли в течение 15 мин на спектрофотометре ПромЭкоЛаб-5400УФ (Санкт-Петербург) при 540 нм.
Концентрацию митохондриального белка определяли УФ-экспресс-методом [7]. Все фракции выравнивали по содержанию белка с помощью буфера (100 мМ сахароза и 10 мМ трис-фос-фат, рН 7.0) до конечной концентрации 0.3 мг/мл.
Спектры флавиновой флуоресценции митохондрий записывали на спектрофлуориметре SLM-4800 (SLM, Inc., США) в 1-см или 0.4-см кюветах при 20°С. Флавиновую флуоресценцию возбуждали в максимуме полосы поглощения при 450 нм и детектировали в максимуме полосы излучения при 525 нм. В ряде опытов, где интенсивность флуоресценции была низкой, в частности при измерении степени поляризации (P) флави-новой флуоресценции, использовали зеркальные кюветы, позволяющие усилить сигнал в несколько раз [4].
Для обнаружения локализации флавина после 2-ч инкубации (при 37°С) суспензию митохондрий пропускали через 0.2-мкм миллипоровые фильтры и затем проводили измерение флуоресценции полученного фильтрата (митохондрии оседали на фильтре). Через такие поры проходят помимо флавинов и флавобелков также протоми-тохондрии (малые зародышевые незрелые митохондрии), но они почти не содержат флавинов [8, 9] и поэтому практически не влияют на измерения. В ряде опытов, в которых митохондрии не мешали измерению флавиновой флуоресценции, их не удаляли. Все измерения проводили по 5—10 раз на митохондриальных фракциях из разных животных, затем находили среднеарифметическое значение, которое выражали в % от контроля.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее в нашей лаборатории было показано, что процесс выхода FMN из активного центра NADH-дегидрогеназы может ускоряться некоторыми веществами, в частности следовыми количествами детергентов, а также небольшим длительным нагреванием. Это согласуется с давно известным фактом полной или частичной утраты FMN в ходе препаративных работ по выделению и очистке изолированной NADH-дегидрогеназы [10—14]. Причем утрата FMN сопровождается падением NADH:убихинон-редуктазной активности, но не NADH:феррицианид-редуктазной. Это связано с тем, что FMN во второй реакции не участвует [4, 6]. Не участвует он и в NADH:тетра-золий-редуктазной реакции [4].
В наших экспериментах по стабилизации фла-виновых молекул в ферменте мы инкубировали митохондрии в течение 2 ч при 37°С. После этого при 20°С измеряли флавиновую флуоресценцию (^возб = 450 нм, ^эмис = 525 нм). Кроме того, мы измеряли триптофановую флуоресценцию (^возб = = 286 нм, ^эмис = 340 нм) для определения выхода из митохондрий белков (большинство белков митохондрий содержат триптофановые остатки) и флуоресценцию 7-аминоактиномицина (^возб = = 530 нм, ^эмис = 620 нм) для определения выхода митохондриальной ДНК (7-аминоактиномицин хорошо встраивается в расплетенные участки ДНК) [4]. Оказалось, что в процессе выхода FMN не происходит никакого выхода белков и ДНК из митохондрий в раствор: интенсивность трипто-фановой флуоресценции и 7-аминоактиномици-новой флуоресценции в среде после 2-ч инкубации митохондрий (при 37°С) и их последующего удаления оставалась пренебрежимо малой (данные не приводятся). Это означает, что митохон-дриальные мембраны остались целыми.
При этом интенсивность флавиновой флуоресценции в контрольных пробах при инкубации возрастала в 2—3 раза (в разных опытах, в зависимости от свойств и сохранности митохондрий). Нужно отметить, что некоторый вклад в общую флавиновую флуоресценцию митохондриальной суспензии дает не только FMN, принадлежащий NADH-дегидрогеназе, но и флавинадениннук-леотиды (FAD), прочно ковалентно связанные с другими митохондриальными дегидрогеназами. Изменение же
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.